趨化性細(xì)胞因子Fractalkine及受體CX3CR1與心肌缺血再灌注關(guān)系研究.pdf

1、心肌缺血再灌注損傷是指缺血期處于可逆損傷的心肌細(xì)胞經(jīng)恢復(fù)血液供應(yīng)后產(chǎn)生新的損傷，是目前醫(yī)學(xué)研究的熱點之一。心肌缺血再灌注的機理并未完全清楚，目前研究表明心肌缺血再灌注損傷本身是種過度的炎癥反應(yīng)的結(jié)果。心肌缺血再灌注時血管內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞激活，白細(xì)胞粘附、聚集，受趨化性細(xì)胞因子趨化到心內(nèi)皮細(xì)胞下，是引起過度炎癥反應(yīng)是其中重要原因。 趨化性細(xì)胞因子(Chemokine)是由8～10KDa小分子量蛋白質(zhì)所組成的細(xì)胞因子超家族，F(xiàn)rac

2、talkine(FKN)是新近發(fā)現(xiàn)的CX3C類趨化性細(xì)胞因子，F(xiàn)KN存在于心血管及其內(nèi)皮細(xì)胞?？缒な荏wCX3CR1分子是FKN的特殊受體。FKN的靶細(xì)胞NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞等上都存在FKN的受體。研究證實心肌缺血再灌注后趨化因子如MCP-1、CINC-1、MIP-2快速被吸引到心肌缺血、梗塞部位，但多種抑制MCP-1、MIP-2的方法均不能完全消除白細(xì)胞在缺血再灌注心肌的募集，故完全可能存在除

3、MCP-1、MIP-2外的趨化因子參與缺血再灌注損傷，作為趨化因子的一員，F(xiàn)KN雖無參與心肌缺血再灌注的文獻報道，但有參與腦組織缺血再灌注報道，并在其它急性炎癥反應(yīng)中FKN和CX3CR1對白細(xì)胞游走和粘附有重要的影響，故我們有理由認(rèn)為其可能參與了同是急性炎癥反應(yīng)的心肌缺血再灌注。FKN與心肌急性缺血再灌注研究較罕見，這可能與FKN被發(fā)現(xiàn)較晚研究滯后有關(guān)。在心肌缺血再灌注中何種細(xì)胞分泌了FKN(趨化因子可由多種細(xì)胞、病毒分泌)；FKN又是

4、通過何種途徑參與心肌缺血再灌注；目前有否影響FKN的治療方法等是目前尚未解決的問題，將是我們研究的重點。本課題分三個部分從離體到在體進行研究。 方法： 第一部分：體外培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞、心肌成纖維細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，并鑒定。建立缺氧復(fù)氧模型，模擬缺血再灌注損傷，觀察三種細(xì)胞在缺血前、缺血再灌注后即刻、再灌注后30min、1小時、2小時、3小時、4小時7個時間段MTT比色法檢測的細(xì)胞存活率及RT-PCR檢測的FKN的mR

5、NA表達。 第二部分：根據(jù)第一部分實驗結(jié)果，選取一種在缺血再灌注中主要表達FKN的細(xì)胞(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)，分為單純?nèi)毖踉俟嘧⒔M、PDTC(10 μmol/L)干預(yù)組，均分為缺血前、缺血再灌注后即刻、再灌注后15min、30min、1小時、2小時、3小時7個時間段，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞核NF-kappaBp65。缺氧復(fù)氧后2小時檢測不同不同濃度的PDTC對缺氧再灌注后FKN的mRNA表達的影響。 第三部分：結(jié)扎SD大鼠的冠

6、狀動脈，建立大鼠缺血再灌注模型，45只大鼠隨機分成假手術(shù)組、缺血再灌注組、辛伐他汀干預(yù)組。每組均分為再灌注后1小時、2小時、4小時三個時間段，心肌梗塞范圍測定及用免疫組化方法觀察在心肌中FKN及在白細(xì)胞中的受體CX3CR1的變化。 結(jié)果： 第一部分：體外培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞、心肌成纖維細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞成功并通過鑒定。三種細(xì)胞缺氧復(fù)氧后即刻存活率均明顯下降，而心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞在復(fù)氧后3、4小時再次出現(xiàn)存活率下降，成纖維

7、細(xì)胞無此改變，復(fù)氧后3、4小時成纖維細(xì)胞存活率明顯高于心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。在缺氧復(fù)氧后心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞確實表達了FKN，而成纖維細(xì)胞則在整個缺氧復(fù)氧過程中沒有FKN的表達。在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，缺氧復(fù)氧后0.5小時即開始有少量的FKN表達，后逐漸增加，于復(fù)氧后2小時到達表達最高值，其后仍有少量表達。心肌細(xì)胞在缺氧復(fù)氧后也有FKN的表達，也是缺氧復(fù)氧后0.5小時即開始有少量的FKN表達，后逐漸增加，于復(fù)氧后2小時到達表達最高值，但第3、

8、4小時卻未見表達，且表達量在每個時間段均低于內(nèi)皮細(xì)胞。 第二部分：內(nèi)皮細(xì)胞缺氧前兩組的NF—KB表達處于一較低水平，無差異。復(fù)氧即刻NF-KBp65活化即明顯增加，隨著細(xì)胞再灌注時間延長，細(xì)胞NF-kB的表達逐漸增加，在復(fù)氧后1小時達高峰，(與0.5小時有顯著差異)，隨后時間段NF-k3的無差異，出現(xiàn)兩平臺期，一出現(xiàn)在復(fù)氧后即刻到l小時，1小時升高后再次出現(xiàn)平臺。與缺氧復(fù)氧組比較，PDTCl0 μ mol/L可在各時間段明顯降低

9、NF-kB的活化，但不能完全抑制，其時間規(guī)律同缺氧復(fù)氧組。與單純?nèi)毖鯊?fù)氧比較，不同劑量的PDTC均可降低FKN表達，PDTC劑量越大，對FKN表達抑制越明顯，甚至可完全抑制FKN的表達。 第三部分：與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組、辛伐他汀組再灌注后1小時FKN蛋白均顯著上調(diào)，并于2小時達高峰，CX3CR1蛋白表達于間質(zhì)浸潤白細(xì)胞，并與FKN表達呈現(xiàn)相似的動態(tài)變化特征。辛伐他汀組不同時間段FKN和CX3CR1的表達均低于缺血再灌注組

10、。 結(jié)論： 第一部分：①乳鼠心肌細(xì)胞、心肌成纖維細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在缺氧復(fù)氧后存活率均下降。②趨化性細(xì)胞因子FKN參與心肌缺血再灌注過程，心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞在缺氧復(fù)氧后表達FKN，2小時達高峰，且內(nèi)皮細(xì)胞是表達FKN的主要細(xì)胞。③心肌成纖維細(xì)胞不表達FKN 第二部分：①單純?nèi)毖蹩梢砸鹑四氺o脈內(nèi)皮細(xì)胞中NF-KBp65表達的上調(diào)。隨著細(xì)胞再灌注時間延長，NF-kB活化程度呈上升趨勢，但在復(fù)氧后l小時達高峰，隨

11、后NF-kB的活化呈現(xiàn)平臺狀。②NF—-KB的特異性阻滯劑PDTC可有效阻止FKN的表達間接證實了FKN表達是由NF-kB調(diào)控的。同時可見小劑量的PDTC即可降低FKN表達，PDTC劑量增大，可完全抑制FKN的表達。 第三部分：①在體實驗證實趨化因子FKN及其受體CX3CR1參與了缺血再灌注損傷。②辛伐他汀可有效降低FKN及其受體CX3CR1在缺血再灌注中的表達，從而減輕缺血再灌注損傷，同時預(yù)示著FKN-CX3CR1趨化信號可能