PPARα-γ信號通路在高脂性脂肪性肝炎發(fā)病機制中的作用研究.pdf

1、目的:研究核受體PPARα/γ信號通路在高脂性脂肪性肝炎發(fā)病中的作用及其可能的病理機制，為合理使用作用于PPARα/γ靶標(biāo)的藥物治療高脂性脂肪性肝炎提供依據(jù)。
　　方法:體內(nèi)試驗采用雄性SD大鼠，隨機分為溶媒對照組、高脂性脂肪性肝炎模型組、PPAR激動劑非諾貝特20 mg/kg組、PPARγ激動劑羅格列酮4 mg/kg組、非諾貝特+羅格列酮組、PPARα拮抗劑(MK886)1 mg/kg組、PPARγ拮抗劑(GW9662)1 mg

2、/kg組和PPARα/γ拮抗劑組。在用高脂高糖乳劑復(fù)制高脂性脂肪性肝炎模型時，同時給予相應(yīng)的藥物處理6周，然后取血液和肝臟，測定血和肝中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和游離脂肪酸(FFA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)含量、炎癥細胞因子TNF-α、IL-6、IL-8和MCP-1水平，以及血中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平，并計算肝重指數(shù);在光鏡下觀察肝臟的形態(tài)學(xué)改變;采用RT-PCR

3、和Western blot方法檢測肝組織中過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)α/γ、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)-1c、脂肪酸合酶(FAS)、二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)、脂蛋白脂酶(LPL) mRNA和蛋白表達以及NF-κB及它的抑制蛋白IκB-α的蛋白表達情況。
　　體外實驗選用大鼠BRL肝細胞，采用油酸聯(lián)合脂多糖(LPS)復(fù)制高脂性脂肪性肝炎細胞模型，以PPARα/γ激動劑和/或拮抗劑預(yù)處理2h后，測定細胞中P

4、PARα/γ及其靶基因SREBP-1c、FAS、DGAT、肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶(CPT1A)、LPL和參與炎癥的NF-κB及它的抑制蛋白IκB-α表達，用免疫細胞化學(xué)法觀察NF-κB的胞核轉(zhuǎn)位情況，用ELASA法測定上清液中的炎癥細胞因子(IL-6和TNF-α)水平，用比色法測定培養(yǎng)細胞上清液中的ALT、AST和MDA含量。
　　結(jié)果:高脂性脂肪性肝炎大鼠給予PPARα激動劑非諾貝特和/或PPARγ激動劑羅格列酮、PPARα拮抗劑

5、MK886和/或PPARγ拮抗劑GW9662拮抗劑后，可分別使血清和肝組織的TC和TG水平明顯降低和升高(P＜0.05或P＜0.01)，且PPARα/γ激動劑聯(lián)用的調(diào)脂作用更為明顯。非諾貝特能分別增加和減少血清和肝臟FFA的水平(P＜0.01)，而羅格列酮能降低血清和肝臟FFA的水平(P＜0.01)，PPARα/γ激動劑聯(lián)用可以降低肝組織中的FFA水平(P＜0.01)，但對血清中的FFA水平未見有明顯影響。PPARα拮抗劑應(yīng)用后顯著降低

6、血清FFA的水平(P＜0.01)，PPARγ拮抗劑、PPARα/γ拮抗劑聯(lián)用均可使血清中的FFA水平顯著增加(P＜0.01)，但PPARα/γ拮抗劑單用或聯(lián)用對肝組織中的FFA水平影響不明顯。結(jié)果提示，非諾貝特和羅格列酮對血清FFA的影響是明顯不同的，但是它們都可降低肝組織中的FFA水平，因此，采用PPARα/γ激動劑聯(lián)用可避免FFA升高產(chǎn)生的不利作用。PPARα/γ激動劑或拮抗劑單用和聯(lián)用可以顯著增加肝組織GSH、SOD和血清GSH的

7、含量(P＜0.05或P＜0.01)，PPARα/γ激動劑單用和聯(lián)用后血清SOD的含量也顯著增加(P＜0.01);而血清和肝組織MDA的含量明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)。給予PPARα/γ拮抗劑后，血清MDA的含量則顯著增加(P＜0.01)，但對肝組織MDA的含量則未見明顯影響。結(jié)果提示，PPARα/γ激動劑聯(lián)用可顯著的降低血清及肝組織中的MDA含量，升高肝組織中GSH的含量，發(fā)揮抗氧化的作用。PPARα/γ激動劑可以明顯降低血

8、清和肝組織TNF-僅，IL-6，IL-8和MCP-1的水平(P＜0.05或P＜0.01)，相反地，給予PPARα/γ拮抗劑后均不同程度的升高，特別是在MK886和GW9662聯(lián)用組升高的更加明顯(P＜0.05或P＜0.01)。同時，羅格列酮可以顯著降低大鼠血清ALT的水平(P＜0.01)。但非諾貝特、非諾貝特聯(lián)合羅格列酮、PPARα/γ拮抗劑對大鼠血清ALT和AST無明顯影響。我們的研究結(jié)果表明，PPARγ的激活可更有效的降低血清和肝組

9、織中的炎性細胞因子水平、肝組織中MDA的含量以及血清ALT的水平，表明氧化應(yīng)激狀態(tài)和炎癥反應(yīng)可能主要由PPARγ來調(diào)控。應(yīng)用非諾貝特、非諾貝特聯(lián)合羅格列酮后可以顯著增加肝重和肝重系數(shù)(P＜0.01)，而應(yīng)用羅格列酮后可以降低肝重和肝重系數(shù)(P＜0.05或P＜0.01)，二者單用或聯(lián)用對大鼠體重?zé)o明顯影響。當(dāng)給予PPARα/γ拮抗劑后，大鼠體重、肝重和肝重系數(shù)均無明顯改變。病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，給予非諾貝特和非諾貝特聯(lián)合羅格列酮后，肝細胞的

10、脂肪變性程度顯著減輕(P＜0.01);非諾貝特和羅格列酮單用和聯(lián)用后，肝細胞的炎性細胞浸潤也明顯減輕(P＜0.05);給予羅格列酮和非諾貝特聯(lián)合羅格列酮后，肝細胞的壞死的程度也明顯的改善(P＜0.05)。非諾貝特和羅格列酮單用和聯(lián)用，均可顯著升高大鼠肝組織中PPARα、PPARγ、LPL mRNA和蛋白以及IκB-α的蛋白表達，降低SREBP-1c、FAS、DGAT mRNA和蛋白表達以及NF-κB的蛋白表達（P＜0.01）;相反，MK

11、886或MK886聯(lián)合GW9662后，可使PPARα mRNA和蛋白表達顯著降低(P＜0.01); GW9662或MK886聯(lián)合GW9662后，則可使PPARγ mRNA和蛋白表達顯著降低(P＜0.01);MK886和GW966單用和聯(lián)用后，均可使用LPL mRNA和蛋白和IB-α的蛋白表達顯著降低而NF-κB、SREBP-1c、FAS、DGAT mRNA和蛋白表達均顯著升高(P＜0.01)，這些基因表達的變化與脂質(zhì)和炎癥因子水平的變化

12、是相一致的，提示PPARα/γ在高脂性脂肪性肝炎的病理機制中起著重要作用。
　　在體外脂肪性肝炎細胞模型上，用PPARα激動劑非諾貝特200μg/mL和/或PPARγ激動劑羅格列酮10μg/mL、PPARγ拮抗劑GW966210μmol/L、非諾貝特聯(lián)合GW9662預(yù)處理2h后，均可見PPARα蛋白表達顯著上調(diào)（P＜0.01）;而用MK8861μmol/L、MK886和羅格列酮預(yù)處理2h后，則對PPARα的蛋白表達有明顯抑制作用(

13、P＜0.05或P＜0.01)。用非諾貝特和/或羅格列酮、MK886、MK886+羅格列酮預(yù)處理2h后，均可使PPARγ的蛋白表達明顯上調(diào)(P＜0.05或P＜0.01);改用GW9662、非諾貝特和GW9662預(yù)處理2h后，則可明顯抑制PPARγ的蛋白表達(P＜0.05或P＜0.01)。非諾貝特和/或羅格列酮、MK886+羅格列酮、非諾貝特+GW9662預(yù)處理后，對SREBP-1c、FAS、DGAT以及CPT1A、LPL的蛋白表達分別具有

14、明顯的下調(diào)和上調(diào)作用;MK886、GW9662預(yù)處理后，對SREBP-1c、FAS、DGAT以及CPT1A、LPL的蛋白表達分別具有明顯的上調(diào)和下調(diào)作用(P＜0.05或P＜0.01)。油紅O染色結(jié)果顯示，PPARα/γ激動劑、PPARα/γ拮抗劑單用或聯(lián)用預(yù)處理后，可以分別減少和增加油酸刺激BRL肝細胞內(nèi)脂滴的含量。非諾貝特和/或羅格列酮、MK886和羅格列酮、非諾貝特和GW9662預(yù)處理后，可明顯降低MDA水平;用MK886、GW96

15、62預(yù)處理則可明顯增加MDA水平(P＜0.05或P＜0.01)。非諾貝特和/或羅格列酮預(yù)處理后，均可明顯降低ALT、AST的水平，MK886、GW9662均可明顯增加ALT、AST的水平(P＜0.05或P＜0.01)。對細胞因子而言，非諾貝特和/或羅格列酮、MK886和羅格列酮、非諾貝特和GW9662的預(yù)處理，可明顯降低TNF-α和IL-6水平，而用MK886、GW9662預(yù)處理后可明顯增加TNF-α和IL-6水平(P＜0.05或P＜0

16、.01)。非諾貝特和/或羅格列酮、MK886和羅格列酮預(yù)處理后，可明顯下調(diào)NF-κB和上調(diào)IκB-α的蛋白表達以及減少NF-κB的胞核轉(zhuǎn)位，非諾貝特聯(lián)合GW9662也可減少NF-κB的胞核轉(zhuǎn)位，但MK886、GW9662預(yù)處理后，可明顯上調(diào)NF-κB和下調(diào)IκB-α的蛋白表達及有顯著的促NF-κB胞核轉(zhuǎn)位作用(P＜0.01)。這些結(jié)果顯示，給予PPARα/γ激動劑和/或拮抗劑后對脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激和炎癥細胞因子的影響與體內(nèi)結(jié)果相一致。<