饑餓小鼠肝臟中eIF4EBP3的功能及調控機制研究.pdf

1、細胞在面臨外界壓力時,作出快速響應以避免損傷和死亡是非常重要的。翻譯調控通過調控蛋白的表達,是細胞對各種環(huán)境壓力作出快速的響應的一種方式。其中,翻譯起始是真核生物基因表達調控中一個重要的階段,而翻譯起始的關鍵調控步驟是翻譯起始復合物的形成。
　　“饑餓”是研究能量代謝及真核翻譯起始調控機制的一個很好的模型。時常有一些饑餓相關的基因,最終證實是代謝調控相關基因。饑餓狀態(tài)下為了節(jié)約能量,肝臟中蛋白合成速率明顯受抑制,這與功能型翻譯起始

2、復合物量的降低相關。翻譯起始復合物eIF4F(eukaryotic initiation factor4F)中eIF4E(eukaryotic initiation factor4E)與mRNA5’端帽子結構的結合是該階段的核心。而eIF4E結合蛋白(eIF4E binding proteins,4E-BPs)正是通過與eIF4E的相互作用而調控翻譯起始過程,進而調控翻譯的速率。4E-BPs抑制翻譯起始調控的方式主要有自身磷酸化和競爭性

3、與eIF4E相結合阻止eIF4F復合物的形成。
　　已有研究報道,在饑餓大鼠中,肝臟翻譯速率下降,結合的4E-BP1并沒有增加,但eIF4E結合的elF4G量卻顯著減少。eIF4E與eIF4G的結合是真核翻譯起始復合物eIF4F形成的核心,在此過程中,應有其他調控因子參與才能解釋翻譯速率的降低。翻譯起始的調控是翻譯速率的調控的重要階段,且需要大量的真核翻譯起始因子的協同作用才能完成。目前,對于饑餓小鼠肝臟中翻譯速率降低的機制,并沒

4、有給出很好的解釋。對此方向的深入研究不僅可以進一步闡明饑餓下肝臟翻譯速率降低的分子機制,還可豐富人們對發(fā)育過程中真核生物基因表達調控機制的認識。深入了解饑餓小鼠肝臟翻譯調控的機制,具有重要的實際應用價值:一方面可以為研究能量代謝提供理論依據;另一方面,也將有助于糖代謝和脂代謝相關疾病的新的治療靶點及治療方法的研究。
　　為了進一步深入研究饑餓狀態(tài)下肝臟中蛋白合成受抑制的分子機制,構建了饑餓小鼠肝臟模型,提取了小鼠總RNA,并對其進

5、行了mRNA的純化。并進行基因表達譜芯片檢測和數據處理,通過IPA(Ingenuity Pathway Analysis)平臺構建了饑餓狀態(tài)下小鼠肝臟的轉錄控制網絡。通過對網絡結構分析,發(fā)現該網絡以若干核心轉錄因子為核心,控制著一批基因的表達量發(fā)生改變。然而,存在大量的未與該控制網絡相連接的孤立分子,提示此類分子的轉錄控制研究尚未明了。對此類孤立分子,綜合表達信號檢測可信度、表達量變化程度、已有研究的深入程度等方面因素考慮,選擇基于IP

6、A構建的轉錄調控網絡中,屬于無上下游調控關系的孤立分子,而且罕有文獻報導其功能的ANKHD1分子。因此,研究該基因的上下游調控關系可將該孤立分子與調控網絡連接,并進一步揭示該分子在能量不足時表達量改變的原因及其結果。在進一步驗證時,發(fā)現代表ANKHD1分子的探針集其反映的是eIF4EBP3表達量變化。
　　eIF4EBP3是4E-BPs家族的一員,其可競爭性與eIF4E相結合,阻止翻譯起始復合物eIF4EF的形成從而調控翻譯的起始

7、。4E-BPs抑制翻譯起始調控的方式主要有自身磷酸化和競爭性與eIF4E相結合阻止eIF4F復合物的形成。目前,對饑餓小鼠肝臟中,eIF4EBP3的調控并沒有很好的闡述。本研究發(fā)現,在饑餓小鼠肝臟中代表eIF4EBP3的探針集表達量顯著上升,進一步通過檢測mRNA水平和蛋白水平表達量證實其確實表達量上調。通過文獻調研,對eIF4EBP3在饑餓小鼠肝臟中表達上調的調控機制提出了假設:肝細胞核因子4α(HNF4α,Hepatocyte nu

8、clear factor-4α;NR2A1)是eIF4EBP3的轉錄因子,并且HNF4α對eIF4EBP3轉錄活性的調控需要過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活子1α(PGC-1α,peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α)的輔助。肝細胞核因子4α是肝臟中重要轉錄因子,其調控肝臟中大多數基因的表達。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活子1α作為轉錄共激活因子,其在

9、肝臟中調控糖異生相關的基因表達,其在調控過程中需要HNF4α。通過m7-GTP-pull-down技術,發(fā)現eIF4EBP3在饑餓小鼠肝臟中,其結合更多的eIF4E,而其家族其他成員(eIF4EBP1和eIF4EBP2)結合的eIF4E的量并沒有顯著增加。根據假設,分別構建了eIF4EBP3啟動子的全長、突變體、敲除體和截短體。利用熒光素酶報告基因實驗,證實了在eIF4EBP3啟動子的上游確實存在著HNF4α的順式轉錄元件。同時通過Ch

10、IP實驗證實了在eIF4EBP3啟動子與HNF4α存在相互作用,說明HNF4α是eIF4EBP3的轉錄激活因子。構建HNF4α和PGC-1α的表達載體,并與eIF4EBP3表達載體共轉染,借助熒光素酶報告基因實驗證實了eIF4EBP3的上調由PGC-1α和HNF4α共同調控。
　　上述結果表明:饑餓小鼠肝臟中,eIF4EBP3表達上調,且eIF4E結合更多的eIF4EBP3,部分解釋了eIF4E結合的eIF4G減少的原因。HNF4