HBx基因影響HepG2細(xì)胞生物學(xué)特性及DNA修復(fù)酶hMTH1、hMYHα與hOGG1表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 (1)觀察HBx基因?qū)epG2細(xì)胞增殖、周期和凋亡等生物學(xué)特性的影響，初步探討細(xì)胞周期蛋白p21在其中的作用和意義。
　　 (2)觀察構(gòu)建的HBx轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型HepG2/HBx中8-OHdG含量及DNA修復(fù)酶hOGG1，hMYHα,hMTH1 mRNA表達(dá)的改變，從DNA修復(fù)酶這一新的角度探討HBx在肝細(xì)胞癌發(fā)生機(jī)制中的作用。
　　 方法：
　　 (1)以四唑藍(lán)(MTT)比色法檢測HBx

2、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞HepG2/HBx及對照組HepG2 與HepG2/pcDNA3.1細(xì)胞(轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1的HepG2細(xì)胞)的增殖情況。
　　 (2)流式細(xì)胞術(shù)檢測HepG2/HBx及對照組細(xì)胞的周期和凋亡情況，并以半定量RT-PCR檢測各組細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白p21 mRNA的表達(dá)。
　　 (3)應(yīng)用HPLC/ECD法檢測穩(wěn)定表達(dá)HBx的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞HepG2/HBx及其對照組HepG2與HepG2/pcDNA3.1細(xì)

3、胞中的8-OHdG的含量。
　　 (4)以β-actin為內(nèi)對照，應(yīng)用RT/實(shí)時(shí)PCR定量檢測DNA修復(fù)酶hOGG1，hMYHα，hMTH1 mRNA在HepG2/HBx細(xì)胞，對照組HepG2細(xì)胞與空質(zhì)粒對照組HepG2/pcDNA3.1細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 (1)MTT比色法顯示HepG2/HBx細(xì)胞生長速度加快；流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)HepG2/HBx中G0/G1期細(xì)胞比例較對照組顯著減少(43.3

4、4±3.11％vs 57.69±4.28[％]，P<0.01)，S期細(xì)胞比例明顯增加(28.69±1.17％vs 22.41±1.99[％]，P<0.05)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)與對照組相比其凋亡率也顯著降低(1.19±0.06％vs 5.43±0.42[％]，P<0.001)。半定量RT-PCR的結(jié)果表明細(xì)胞周期蛋白p21 mRNA在HepG2/HBx細(xì)胞中的表達(dá)較對照組細(xì)胞顯著降低(0.16±0.05vs 0.78±0.15，P<0.001)

5、。
　　 (2) 8-OHdG在HepG2/HBx細(xì)胞中的含量顯著高于對照組HepG2和HepG2/pDNA3.1細(xì)胞(36.5±6.25vs 8.52±1.65fmol 8-OHdG/mg DNA，P<0.05)。
　　 (3)RT/實(shí)時(shí)PCR定量檢測發(fā)現(xiàn)DNA修復(fù)酶hMTH1在HepG2/HBx細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于HepG2和HepG2/pcDNA3.1細(xì)胞(1.213±0.100vs0.087±0.026 hMTH

6、1/β-actin mRNA×100,P<0.05)，相反DNA修復(fù)酶hMYHα在HepG2/HBx細(xì)胞中的表達(dá)卻明顯低于HepG2和HepG2/pcDNA3.1細(xì)胞(0.021±0.007vs 0.099±0.041 hMYHα/β-actin mRNA×100,P<0.05)，而DNA修復(fù)酶hOGG1 mRNA在各組細(xì)胞中的表達(dá)無顯著差異(p>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)HBx基因可能具有加速HepG2細(xì)