血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）對腎小管上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用及機制探討.pdf

1、第一部分血管內(nèi)皮生長因子對腎小管上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用及其與BMP-7、Id變化的關(guān)系 目的：本研究探討VEGF對腎小管上皮EMT的作用及其與BMP-7、Id2及Id3變化的關(guān)系。 方法： 實驗一:觀察不同濃度的VEGF對TGF-β1誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的影響及BMP-7、Id的變化，分組為：(1)正常對照組；(2)TGF-β1陽性對照組；(3)TGF-β1+VEGF165共同作用組：T

2、GF-β1與不同劑量VEGF165共同作用，各組作用時間均為48h，免疫組化雙染方法檢測各組HK-2細(xì)胞α-SMA、E-cadherin表達(dá)情況，Western Blot法檢測各組細(xì)胞α-SMA、BMP-7、Id2及Id3蛋白水平。 實驗二:分別觀察VEGF、VEGFR1抗體對TGF-β1誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的影響及BMP-7、Id的變化，分組為：(1)正常對照組；(2)TGF-β1陽性對照組；(3)VEG

3、F165作用組；(4)VEGFR1抗體作用組；(5)TGF-β1+VEGF165共同作用組；(6)TGF-β1+VEGFR1抗體共同作用組，各組作用時間均為48h，免疫組化雙染方法檢測各組HK-2細(xì)胞α-SMA、E-cadherin表達(dá)情況，Real-time PCR法、Western Blot法檢測各組細(xì)胞α-SMA、BMP-7、Id2、Id3mRNA及蛋白水平。 實驗三"觀察中和內(nèi)源性的BMP-7后，VEGF對TGF-β1誘

4、導(dǎo)的體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT影響的變化及Id2的變化，HK-2細(xì)胞分組為：(1)正常對照組；(2)TGF-β1陽性對照組；(3)VEGF165作用組；(4)Alk6/Fc chimera作用組：AIk6/Fc chimera可與內(nèi)源性BMP-7結(jié)合從而抑制其活性；(5)TGF-β1+VEGF165共同作用組；(6)TGF-β1+Alk6/Fc chimera共同作用組；(7)VEGF165+Alk6/Fc chimera共同

5、作用組；(8)TGF-β1+VEGF165+AIk6/Fc chimera共同作用組，各組作用時間均為48h，Western Blot法檢測細(xì)胞α-SMA、Id2水平。 結(jié)果:免疫組化雙染、Real-time PCR、Wcstcm Blot方法均顯示，TGF-β1陽性對照組較正常對照組α-SMA mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著增強，而E-cadherin表達(dá)顯著減弱，BMP-7、Id2及Id3mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低。TGF-

6、β1+VEGF165共同作用組同TGF-β1陽性對照組相比，α-SMA蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，而E-cadherin表達(dá)則有部分恢復(fù)，BMP-7及Id2蛋白水平顯著升高(P<0.05)，Id3蛋白水平無顯著變化。VEGF165以濃度依賴方式增強HK-2細(xì)胞BMP-7及Id2蛋白表達(dá)。TGF-β1+VEGFR1抗體共同作用組同TGF-β1陽性對照組相比，α-SMA mRNA及蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步增強(P<0.05)，而E-ca

7、dherin表達(dá)則幾乎消失，BMP-7、Id2 mRNA及蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步降低(P<0.05)，Id3 mRNA及蛋白表達(dá)水平無顯著變化。TGF-β1+VEGF165+Alk6/Fc chimera共同作用組同TGF-β1+VEGF165共同作用組比較，α-SMA蛋白表達(dá)增強(P<0.05)，而Id2蛋白表達(dá)無顯著變化。 結(jié)論:VEGF165可抑制TGF-β1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生的EMT，其機制可能與BMP-7和Id2表達(dá)的上

8、調(diào)有關(guān)，而與Id3的表達(dá)變化無關(guān)；且VEGF165可能具有直接的上調(diào)Id2表達(dá)的作用，而與BMP-7變化無關(guān)。 第二部分血管內(nèi)皮生長因子對TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中Smad2、Smad3途徑的影響 目的：血管內(nèi)皮生長因子對維持血管內(nèi)皮細(xì)胞生存、再生及其功能穩(wěn)定發(fā)揮關(guān)鍵作用。TGF-β1通過Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與調(diào)節(jié)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化，其中Smad2、Smad3的磷酸化是關(guān)鍵步驟。研究表明，VEGF可下

9、調(diào)TGF-β刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Smad2/3的磷酸化水平，發(fā)揮抑制TGF-β的作用，但對腎小管上皮細(xì)胞Smads作用如何尚不清楚。本研究探討VEGF在TGF-β1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT的過程中對Smad2、Smad3途徑的影響。 方法：分兩個步驟進(jìn)行：實驗一：觀察不同濃度的VEGF對TGF-β1誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的影響及Smad2/3磷酸化水平的變化，分組為：(1)正常對照組；(2)TGF-β1陽性

10、對照組；(3)TGF-β1+VEGF165共同作用組：TGF-β1與不同劑量VEGF165共同作用，各組作用時間均為48h，Western Blot法檢測各組細(xì)胞α-SMA、p-Smad2/3和Smad2/3蛋白水平。 實驗二：分別觀察VEGF、VEGFR1抗體對TGF-β1誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的影響及Smad2/3磷酸化水平的變化，分組為：(1)正常對照組；(2)TGF-β1陽性對照組；(3)VEGF16

11、5作用組；(4)VEGFR1抗體作用組；(5)TGF-β1+VEGF165共同作用組；(6)TGF-β1+VEGFRl抗體共同作用組，各組作用時間均為48h，Real-time PCR方法檢測HK-2細(xì)胞α-SMAmRNA表達(dá)情況，Western Blot法檢測各組細(xì)胞P-Smad2/3和Smad2/3蛋白水平。 結(jié)果：實驗一 Western Blot方法顯示，TGF-β1陽性對照組HK-2細(xì)胞較正常對照組α-SMA蛋白表達(dá)水平

12、顯著增強(P<0.05)，同時細(xì)胞/二者比值即Smad2/3磷酸化水平升高(P<0.05)；TGF-β1與不同濃度VEGF165共同作用組同TGF-β1陽性對照組相比，α-SMA蛋白表達(dá)水平及(p-Smad2/3)/(Smad2/3)二者比值即Smad2/3磷酸化水平呈下降趨勢，表現(xiàn)為劑量依賴性，較高濃度的VEGF165共同處理組有顯著性差異(P<0.05)。 實驗二 Real-time PCR方法及Western Blot方法

13、顯示，TGF-βl與VEGFR1抗體共同作用組同TGF-β1陽性對照組相比，α-SMAmRNA表達(dá)水平進(jìn)一步增強(P<0.05)，同時細(xì)胞(p-Smad2/3)/(Smad2/3)二者比值即Smad2/3磷酸化水平進(jìn)一步升高(P<0.05)。 結(jié)論：VEGF165可呈劑量依賴性抑制TGF-β1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生的EMT，其機制可能與磷酸化的Smad2/3表達(dá)下調(diào)有關(guān)。 第三部分麥考酚酸酯對大鼠腎問質(zhì)纖維化和腎小管上皮-

14、間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用及機制探討 目的：麥考酚酸酯是一種免疫抑制劑，其代謝產(chǎn)物麥考酚酸可高度選擇性、非競爭性、可逆性地抑制次黃嘌呤單核苷酸脫氫酶。MMF主要用于治療免疫性疾病，近年實驗研究表明，MMF具有抗纖維化的作用，但其機制尚不明確。本研究探討MMF對腺嘌呤致大鼠慢性腎衰模型的腎間質(zhì)纖維化及腎小管上皮.間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用，以及該作用同腎組織血管內(nèi)皮生長因子及分化抑制因子變化的關(guān)系。 方法：雄性Wistar大鼠64只，分為3組

15、：1、正常組(n=16)；2、慢性腎衰模型組：腺嘌呤125mg.kg-1.d-1灌胃；3、MMF治療組：腺嘌呤125 mg.kg-1.d-1+MMF15 mg.kg-1.d-1灌胃。分別于第2、4、6、8周處死動物，處死前1天留取24小時尿，檢測尿蛋白。處死前心臟取血，生化自動分析儀檢測血肌酐值。同時留取腎組織，HE和Masson染色行腎間質(zhì)纖維化程度評分；免疫組化法檢測腎組織α-SMA、TGF-β1表達(dá)情況；RT-PCR方法檢測腎組織

16、TGF-β1、VEGFmRNA水平的表達(dá)情況；Western Blot方法檢測腎組織α-SMA、VEGF、Id2、Id3蛋白水平的表達(dá)情況。 結(jié)果：隨腺嘌呤給藥時間延長，MMF治療組與CRF模型組血肌酐逐漸升高，與正常組比較差異顯著(P<0.01)，但MMF治療與CRF兩組間無顯著性差異(P>0.05)。MMF治療組在第6、8周，24小時尿蛋白水平較CRF模型組下降(P<0.01)。同正常組比較，CRF模型組與MMF治療組在第6

17、、8周腎間質(zhì)纖維化程度明顯加重(P<0.01)，且MMF治療組腎間質(zhì)纖維化程度較CRF模型組均減輕(P<0.01)。同正常組比較，CRF模型組及MMF治療組腎組織α-SMA表達(dá)水平在第6、8周明顯增強(P<0.01)，且MMF治療組腎組織α-SMA表達(dá)水平較CRF模型組降低(P<0.01)。同正常組比較，CRF模型組及MMF治療組腎組織TGF-β1表達(dá)增加(P<0.05)，MMF治療組較CRF模型組降低，在第2、4、6周有顯著差異(P<

18、0.01)。同正常組比較，在第8周CRF模型組腎組織VEGF蛋白表達(dá)下降(P<0.01)，MMF治療組腎組織VEGF表達(dá)在第6、第8周顯著高于CRF模型組(P<0.01)。MMF治療組腎組織Id2、Id3表達(dá)較CRF模型組增強，在第4、6周差異顯著(P<0.05)。 結(jié)論：在腺嘌呤致大鼠慢性腎衰模型中，麥考酚酯酸具有減輕腎間質(zhì)纖維化的作用，該作用可能與抑制腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、腎組織TGF-β1表達(dá)的下調(diào)及VEGF、Id2、Id