血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子過(guò)表達(dá)對(duì)腎小管上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制作用及機(jī)制探討.pdf

1、第一部分血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)穩(wěn)定過(guò)表達(dá)腎小管上皮細(xì)胞系(HKG細(xì)胞系)的建立
　　 背景與目的:
　　 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在維持血管內(nèi)皮細(xì)胞生存、增殖及調(diào)節(jié)血管新生和重構(gòu)方面有非常重要的作用。正常情況下，胎兒與成人腎組織的VEGF主要來(lái)源于足突細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞，腎小管上皮細(xì)胞可分泌VEGF121和VEGF165，是腎小管-間質(zhì)中VEGF的主要來(lái)源。我們以前的多次實(shí)驗(yàn)證實(shí)，VEGF能抑制TGF-β1誘

2、導(dǎo)的腎小管上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition， EMT)。但是實(shí)驗(yàn)都是采用外源性的VEGF刺激體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞(HKC)，具體的作用機(jī)制還不明確。因此，我們通過(guò)建立VEGF穩(wěn)定過(guò)表達(dá)HKC細(xì)胞系，模仿體內(nèi)環(huán)境，使HKC細(xì)胞能同時(shí)分泌VEGF121和VEGF165，進(jìn)一步探討VEGF對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的EMT的抑制作用及其作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 全基因合成目

3、的序列VEGF121和VEGF165，構(gòu)建目的基因VEGF121到pBuDCE4.1載體的CMV啟動(dòng)子下，并構(gòu)建目的基因VEGF165到EF-1α啟動(dòng)子下，同時(shí)插入抗性zeocin。測(cè)序驗(yàn)證含有目的序列的正確質(zhì)粒編號(hào)為Z7842-2，抗性為Zeocin。采用電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法，將Z7842-2質(zhì)粒導(dǎo)入HKC細(xì)胞，并通過(guò)逐步用zeocin加壓的方法進(jìn)行篩選，最后用ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液上清中VEGF濃度。
　　 結(jié)果:
　

4、　 正常HKC細(xì)胞培養(yǎng)液上清中VEGF濃度為112.918pg/ml，而被轉(zhuǎn)入Z7842-2質(zhì)粒的HKC細(xì)胞培養(yǎng)液上清中VEGF的濃度為1210.061 pg/ml，后者的濃度是前者的10.72倍(p＜0.05)。因此認(rèn)為VEGF穩(wěn)定過(guò)表達(dá)HKC細(xì)胞系（簡(jiǎn)稱(chēng)為VEGF過(guò)表達(dá)HKC細(xì)胞系）已經(jīng)建立。
　　 結(jié)論:
　　 成功構(gòu)建VEGF穩(wěn)定過(guò)表達(dá)HKC細(xì)胞系。
　　 第二部分血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)過(guò)表達(dá)對(duì)腎

5、小管上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和Smad3表達(dá)的抑制
　　 背景與目的:
　　 TGF-β1主要通過(guò)TGF-β1/Smad途徑發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)， Smad蛋白是TGF-β1受體后主要的信使分子，介導(dǎo)TGF-β1信號(hào)從細(xì)胞膜傳入細(xì)胞核。腎小管上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是腎間質(zhì)纖維化的重要途徑。Smad3在TGF-β1誘導(dǎo)的EMT過(guò)程中發(fā)揮重要作用。我們多次的實(shí)驗(yàn)證明，VEGF能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管EMT。近來(lái)，我們已經(jīng)成

6、功建立了VEGF穩(wěn)定過(guò)表達(dá)HKC細(xì)胞系。因此本實(shí)驗(yàn)的目的是探討VEGF過(guò)表達(dá)抑制EMT和對(duì)Smad3的影響。
　　 方法:
　　 將體外培養(yǎng)的細(xì)胞分為以下幾組:A.正常HKC組，B.正常HKC加入TGF-β1（5μg/l）刺激24小時(shí)和48小時(shí)組，C.VEGF過(guò)表達(dá)HKC組，D.VEGF過(guò)表達(dá)HKC加入TGF-β1（5μg/l）刺激24小時(shí)和48小時(shí)組。Western-blot方法檢測(cè)TGF-β1信號(hào)通路中的重要分子Sm

7、ad2及Smad3的表達(dá)，同時(shí)用RT及Real Time PCR方法檢測(cè)Smad3基因的表達(dá)情況。Western-blot方法及激光共聚焦方法檢測(cè)上皮細(xì)胞的標(biāo)志蛋白E-鈣黏素(E-cadherin)的表達(dá)及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的標(biāo)志蛋白α-平滑肌動(dòng)蛋白(α-SMA)表達(dá)。ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)液上清中VEGF的濃度變化。40倍倒置光學(xué)顯微鏡下觀察各組細(xì)胞在加入TGF-β1刺激不同時(shí)間后細(xì)胞形態(tài)的變化。
　　 結(jié)果:
　　 B組

8、的α-SMA的表達(dá)較A組明顯增加(p＜0.05);B組的E-鈣黏素明顯低于A組(p＜0.05)。D組的α-SMA的表達(dá)較B組下降(p＜0.05)，E-鈣黏素較B組明顯增加(p＜0.05)。B組P-Smad3的表達(dá)明顯高于A組(p＜0.05);D組P-Smad3的表達(dá)明顯低于B組。C組Smad3的表達(dá)較A組明顯減少(p＜0.05)， D組Smad3的表達(dá)較B組明顯減少(p＜0.05)。B組P-Smad3/Smad3的比值較A組明顯增加(p

9、＜0.05)，D組P-Smad3/Smad3的比值較B組下降(p＜0.05)。
　　 40倍倒置光學(xué)顯微鏡下觀察，正常HKC細(xì)胞呈鵝卵石樣，在加入TGF-β1刺激24小時(shí)后，細(xì)胞變成梭形;在加入TGF-β1刺激48小時(shí)后，這種變化更為明顯。而VEGF過(guò)表達(dá)HKC細(xì)胞也是呈鵝卵石樣外觀，在加入TGF-β1刺激24及48小時(shí)后，細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有明顯變化。
　　 結(jié)論:
　　 HKC細(xì)胞VEGF過(guò)表達(dá)能明顯減弱TGF-β1

10、誘導(dǎo)的EMT; VEGF的這一作用與TGF-β1信號(hào)途徑中的Smad3的表達(dá)下調(diào)及磷酸化抑制有關(guān)。
　　 第三部分血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)過(guò)表達(dá)下調(diào)Smad3表達(dá)通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路
　　 背景與目的:
　　 腎小管上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，是腎間質(zhì)纖維化的重要機(jī)制之一。TGF-β1/Smad信號(hào)通路在EMT過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而Smad3是TGF-β1/S

11、mad信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。我們的多次研究表明，VEGF能抑制TGFβ1誘導(dǎo)的腎小管EMT。PI3K/Akt信號(hào)通路是VEGF發(fā)揮作用的主要通路之一。LY294002是PI3K活性的特異性抑制劑。我們已經(jīng)成功建立了VEGF過(guò)表達(dá)HKC細(xì)胞系。本部分實(shí)驗(yàn)的目的是，探討VEGF過(guò)表達(dá)可否通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路抑制Smad3的表達(dá)，從而抑制TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管EMT。
　　 方法:
　　 將體外培養(yǎng)的細(xì)胞分為以下幾

12、組:.A組:正常HKC組;B組:正常HKC加入TGF-β1（5μg/l）刺激刺激24小時(shí)及48小時(shí)組;C組:VEGF過(guò)表達(dá)HKC組;D組:VEGF過(guò)表達(dá)HKC加入TGF-β1（5μg/l）刺激24小時(shí)及48小時(shí)組;E組:VEGF過(guò)表達(dá)HKC加入TGF-β1(5μg/l)及LY294002(20μmol/l)刺激24小時(shí)及48小時(shí)組。
　　 Western Blot法檢測(cè)各組細(xì)胞磷酸化的PI3K(P-PI3K)、PI3K、磷酸化的

13、Akt、Akt、磷酸化的Smad3、Smad3、平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)以及E鈣黏素(E-cadherin)的表達(dá)。熒光實(shí)時(shí)定量PCR(real time PCR)方法檢測(cè)Smad3基因的表達(dá)情況。激光共聚焦檢測(cè)α-SMA及E-cadherin的表達(dá)情況。倒置光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。
　　 結(jié)果:
　　 C組PI3K的表達(dá)較A組增加(p＜0.05);C組的PI3K在P55位點(diǎn)的磷酸化水平較A組增加(p＜0.

14、05); VEGF過(guò)表達(dá)HKC加入TGF-β1刺激48小時(shí)的P-PI3K較正常HKC加入TGF-β1刺激48小時(shí)明顯增加(p＜0.05);E組磷酸化的PI3K水平，較其他組明顯下降(p＜0.05)（除A組外）。
　　 AKT的表達(dá)除了正常HKC細(xì)胞加入TGF-β1刺激48小時(shí)較低之外，其他組的表達(dá)量沒(méi)有明顯不同。D組磷酸化的AKT表達(dá)水平較B組明顯升高(p＜0.05)，E組磷酸化的AKT表達(dá)水平較D組明顯下降(p＜0.05)。<

15、br>　　 C組的Smad3基因及蛋白表達(dá)較A組減少(p＜0.05);D組Smad3基因及蛋白表達(dá)較B組減少(p＜0.05);但是，E組的Smad3基因及蛋白表達(dá)較D組升高(p＜0.05)。B組的P-Smad3的表達(dá)及P-Smad3/Smad3值較A組明顯增加(p＜0.05);D組的P-Smad3的表達(dá)及P-Smad3/Smad3值較B組減少(p＜0.05);E組的P-Smad3的表達(dá)及P-Smad3/ Smad3值較D組增加(p＜0

16、.05)。
　　 B組的α-SMA較A組和D組明顯增加(p＜0.05)，但VEGF過(guò)表達(dá)HKC加入TGF-β1刺激48小時(shí)組的α-SMA較正常HKC加入TGF-β1刺激48小時(shí)組明顯增加(p＜0.05)。
　　 A組的E-cadherin明顯高于B組(p＜0.05)，但低于C組(p＜0.05); VEGF過(guò)表達(dá)HKC加入TGF-β1刺激24小時(shí)組的E-cadherin明顯低于VEGF過(guò)表達(dá)HKC細(xì)胞加入TGF-β1及LY

17、294002刺激24小時(shí)組(p＜0.05)。
　　 正常HKC細(xì)胞及VEGF過(guò)表達(dá)HKC細(xì)胞呈鵝卵石樣，在加入TGF-β1刺激24小時(shí)后，細(xì)胞變成梭形;在加入TGF-β1刺激48小時(shí)后，這種變化更為明顯。VEGF過(guò)表達(dá)HKC細(xì)胞在加入TGF-β1刺激后，細(xì)胞開(kāi)始有輕度變成梭形細(xì)胞的趨勢(shì)，但變化不甚明顯。VEGF過(guò)表達(dá)HKC細(xì)胞加入TGF-β1及LY294002刺激后細(xì)胞變?yōu)樗笮巍?br>　　 結(jié)論:
　　 VEGF過(guò)表

18、達(dá)能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)的HKC細(xì)胞發(fā)生EMT，其作用機(jī)制可能與VEGF通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路抑制TGF-β1信號(hào)通路中Smad3表達(dá)及磷酸化有關(guān)。
　　 第四部分血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)過(guò)表達(dá)抑制腎小管上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)與miRNA192表達(dá)變化的關(guān)系
　　 背景與目的:
　　 TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。據(jù)前述報(bào)道，VEGF

19、能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管EMT，并且VEGF主要通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路抑制Smad3的表達(dá)與磷酸化，從而抑制EMT，但其機(jī)制不明確。近來(lái)報(bào)道，miR-192與腎臟纖維化密切相關(guān)。本部分研究目的是探討miR192在VEGF抑制TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管EMT過(guò)程中的調(diào)控作用。
　　 方法:
　　 將體外培養(yǎng)的細(xì)胞分為以下幾組:A.正常HKC組，B.正常HKC加入TGF-β1（5μg/l）刺激24小時(shí)及48小時(shí)組，

20、C.VEGF過(guò)表達(dá)HKC組，D.VEGF過(guò)表達(dá)HKC加入TGF-β1（5μg/l）刺激組刺激24小時(shí)及48小時(shí)組，E.VEGF過(guò)表達(dá)HKC加入TGF-β(5μg/l)及LY294002(20μmol/l)刺激24小時(shí)及48小時(shí)組;熒光實(shí)時(shí)定量PCR(real time PCR)方法檢測(cè)miR192及Smad3基因的表達(dá)情況;采用SPSS11.5軟件對(duì)miR192和Smad3基因的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)分析。
　　 結(jié)果:
　　 正

21、常HKC細(xì)胞在加入TGF-β1刺激48小時(shí)后，miR192的表達(dá)較A組明顯增加(p＜0.05);VEGF過(guò)表達(dá)HKC細(xì)胞在加入TGF-β1刺激48小時(shí)后，miR192的表達(dá)較正常HKC細(xì)胞加入TGF-β1刺激48小時(shí)后明顯降低(p＜0.05); VEGF過(guò)表達(dá)HKC細(xì)胞在加入TGF-β1及LY294002刺激24小時(shí)后，miR192的表達(dá)較VEGF過(guò)表達(dá)HKC細(xì)胞加入TGF-β1刺激24小時(shí)后明顯增加(p＜0.05)。
　　 B

22、組Smad3基因的表達(dá)較A組明顯升高(p＜0.05);C組Smad3基因的表達(dá)較A組降低(p＜0.05)。D組的Smad3基因的表達(dá)較B組明顯降低(p＜0.05)。但是，E組Smad3基因的表達(dá)較D組明顯升高(p＜0.05)。 Smad3基因與miR192的表達(dá)呈中高度正相關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 在人腎小管上皮細(xì)胞中，TGF-β1能明顯促進(jìn)miR192表達(dá);而VEGF能抑制miR192和Smad3的表達(dá)。Smad3基因