胚期葉酸調(diào)控肉雞IGF2表達(dá)的表觀遺傳機(jī)制.pdf

1、胰島素樣生長因子2（insulin-like growth factor2，IGF2）基因位于雞第5號染色體，包括3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，其編碼的蛋白是一種促有絲分裂多肽，與胰島素具有相似的結(jié)構(gòu)，參與機(jī)體DNA和蛋白合成，在體內(nèi)葡萄糖和脂質(zhì)代謝過程中均發(fā)揮重要作用。同時(shí)，IGF2在機(jī)體的正常生長發(fā)育，尤其是在調(diào)控胚胎發(fā)育上具有重要作用，故多被認(rèn)為是一種胚胎生長因子。葉酸作為一碳基團(tuán)代謝過程中重要的輔酶因子，可攜帶活性甲基基團(tuán)。近年來，隨

2、著表觀遺傳學(xué)的深入研究，有關(guān)葉酸可通過影響DNA甲基化來調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制引起學(xué)者越來越多的關(guān)注。本研究分為3個(gè)部分:(1)首先分析了雞胚發(fā)育過程中肝臟IGF2的動(dòng)態(tài)表達(dá)規(guī)律以及該基因與雞胚發(fā)育的相關(guān)性;(2)進(jìn)而探究了胚期特殊生理階段葉酸的添加對雞胚發(fā)育的影響;(3)并研究了葉酸調(diào)控肉雞IGF2表達(dá)的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。本研究的結(jié)果可為家禽營養(yǎng)表觀遺傳學(xué)研究提供參考。
　　試驗(yàn)一：雞胚發(fā)育中器官生長及肝臟IGF2動(dòng)態(tài)表達(dá)規(guī)律

3、　　本試驗(yàn)連續(xù)統(tǒng)計(jì)并檢測了雞胚發(fā)育第10(E10)到E20雞胚基本生長數(shù)據(jù)和肝臟IGF2的動(dòng)態(tài)表達(dá)規(guī)律，分析該基因表達(dá)與雞胚發(fā)育的相關(guān)性。結(jié)果顯示，肝臟發(fā)育快于心臟，相對于雞胚重，肝臟指數(shù)在15到17胚齡逐日增加并在17胚齡達(dá)到最大(P＜0.05)，雞胚和肝臟的絕對生長在17胚齡也達(dá)到最大;肝臟IGF2的表達(dá)在E14達(dá)到第一個(gè)峰值(P＜0.05)，之后下降并在17胚齡起表達(dá)持續(xù)升高（P＜0.05）;所檢測四個(gè)胚齡的肝臟IGF2啟動(dòng)子區(qū)甲

4、基化隨著胚齡的增加而降低(P＜0.05)，與所對應(yīng)胚齡該基因的表達(dá)水平相對應(yīng);除此之外，肝臟相對于雞胚的指數(shù)與雞胚相對于種蛋的指數(shù)均與肝臟IGF2基因的表達(dá)成正相關(guān)關(guān)系(P＜0.05)，且兩個(gè)指數(shù)之間也存在正相關(guān)(P＜0.05);雞胚的絕對生長與肝臟的絕對生長、雞胚的絕對生長與肝臟IGF2基因的表達(dá)之間均存在正相關(guān)關(guān)系(P＜0.05)。結(jié)果表明，在雞胚的發(fā)育中，肝臟IGF2的表達(dá)與雞胚的生長發(fā)育存在正相關(guān)，并且肝臟該基因表達(dá)水平的上升往

5、往伴隨其啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平的下降。
　　試驗(yàn)二：胚期注射葉酸對雛雞發(fā)育和肝臟IGF2表達(dá)的影響
　　試驗(yàn)選取360枚科寶500種蛋，隨機(jī)分為4個(gè)處理，每處理6重復(fù)，每重復(fù)15枚種蛋，于E11分別注射不同水平（0、50、100、150μg）的葉酸，統(tǒng)計(jì)雛雞生長性能，并通過RT-qPCR檢測肝臟IGF2的表達(dá)，分析基因與仔雞生產(chǎn)性能的關(guān)系，用重亞硫酸鹽修飾克隆測序法(BSP)檢測IGF2啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平，DNaseⅠ-qPC

6、R方法檢測基因啟動(dòng)子區(qū)域染色質(zhì)構(gòu)象。結(jié)果顯示，胚期注射100和150μg葉酸顯著提高了受精蛋孵化率(P＜0.05);胚期150μg葉酸的添加顯著提高了仔雞肝臟IGF2的表達(dá)(P＜0.05)，但低劑量的葉酸對其沒有影響(P＞0.05);與此同時(shí)，與對照組相比，100和150μg葉酸顯著降低了基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平(P＜0.05)，兩個(gè)處理組的DNMT1的表達(dá)也顯著下降(P＜0.05);除此之外，胚期150μg葉酸顯著降低了基因啟動(dòng)子區(qū)的染

7、色質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松度（P＜0.05）;與對照組相比，仔雞的體重、肝臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)在150μg葉酸組也達(dá)到最大(P＜0.05)，并且肝臟IGF2的表達(dá)與仔雞初生重和器官指數(shù)均存在顯著正相關(guān)關(guān)系(P＜0.05)。因此，結(jié)果表明E11注射150μg葉酸通過降低啟動(dòng)子區(qū)甲基化和提高染色質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松度來上調(diào)肝臟IGF2的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)雞胚生長發(fā)育。
　　試驗(yàn)三：胚期葉酸調(diào)控肉雞IGF2表達(dá)的表觀遺傳機(jī)制探究
　　本試驗(yàn)基于試驗(yàn)二的基礎(chǔ)，旨

8、在探究胚期注射葉酸調(diào)控肉雞IGF2表達(dá)的表觀遺傳機(jī)制。在雛雞飼養(yǎng)至第21和42天時(shí)，每重復(fù)屠宰一只雞，取肝臟以及免疫器官胸腺和脾臟組織。用RT-qPCR方法檢測組織中IGF2的相對表達(dá)量;BSP法檢測IGF2啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平;DNaseⅠ-qPCR方法檢測IGF2啟動(dòng)子區(qū)域染色質(zhì)構(gòu)象。結(jié)果表明，胚期不同的葉酸注射水平對21日齡脾、肝和42日齡胸腺中IGF2的表達(dá)均無影響(P＞0.05)，但與對照組相比，150μg葉酸注射組顯著提高了

9、42日齡脾、肝和21日齡胸腺組織中IGF2的表達(dá)（P＜0.05）;不同濃度的葉酸對21日齡脾中IGF2啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平?jīng)]有影響(P＞0.05)，在42日齡，50和150μg葉酸注射組脾中IGF2啟動(dòng)區(qū)甲基化水平顯著降低(P＜0.05);胚期葉酸對胸腺IGF2啟動(dòng)子區(qū)甲基化的影響與脾組織不同，孵化期第11天100和150μg葉酸的注射顯著增加了21日齡胸腺IGF2啟動(dòng)子區(qū)的甲基化(P＜0.05)，但所有葉酸處理組對42日齡基因啟動(dòng)子區(qū)的

10、甲基化均沒有顯著影響(P＞0.05);在肝組織中，150μg葉酸的注射顯著降低了21日齡IGF2啟動(dòng)子區(qū)的甲基化程度(P＜0.05);與對照組相比，100和150μg兩個(gè)劑量的葉酸顯著降低了42日齡基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平(P＜0.05)。150μg葉酸注射組顯著增加了42日齡脾中該基因啟動(dòng)子區(qū)染色質(zhì)的疏松度(P＜0.05)，而50和100μg葉酸注射組對其并沒有顯著影響（P＞0.05）;與對照組相比，21日齡三個(gè)葉酸注射組脾中IGF2

11、啟動(dòng)子區(qū)染色質(zhì)構(gòu)象均沒有顯著變化(P＞0.05)。在胸腺和肝組織中，僅150μg葉酸注射組顯著增加了21日齡胸腺和42日齡肝臟IGF2啟動(dòng)子區(qū)染色質(zhì)可接近度(P＜0.05)，各葉酸處理組對42日齡胸腺和21日齡肝臟該基因啟動(dòng)子區(qū)染色質(zhì)構(gòu)象均無影響(P＞0.05)。由此可見，在種蛋孵化第11天注射葉酸可通過影響基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平和染色質(zhì)構(gòu)象來調(diào)控組織中IGF2的表達(dá)，并且存在組織器官和時(shí)間特異性。
　　本研究表明，肝臟IGF2