絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞(EVT)侵襲的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、“胚胎植入是播種生命之苗，腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移則是扣擊死亡之門”[1]。但是，這兩個截然不同的生理過程，卻在細(xì)胞增殖分化、免疫逃逸和侵襲信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等諸多方面有著驚人的相似之處。胚胎的成功植入需要胚胎絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞(extrayillous trophoblast，EVTs)發(fā)揮類似腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的特性，即識別、黏附并降解細(xì)胞外基質(zhì)，侵入血管內(nèi)皮，從而使母體血管重建，開啟胎盤的血液供應(yīng)。EVT侵襲與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的根本不同是前者受到嚴(yán)格的時空調(diào)控，表現(xiàn)

2、為“有控性侵襲”，后者則表現(xiàn)為“無控性侵襲”[2]。EVT侵襲異常，可引起一系列的妊娠相關(guān)疾?。哼^度侵入可致絨毛膜癌，侵入過淺與自然流產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩、先兆子癇等疾病的發(fā)生相關(guān)。然而，迄今為止人們對遺傳水平的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及激素等調(diào)控因素的研究遠(yuǎn)未能闡明EVT對子宮內(nèi)膜的“有控性侵襲”機(jī)制。
　　目前，調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞分化和發(fā)育的表觀遺傳學(xué)研究已成為滋養(yǎng)細(xì)胞研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)并取得較多成果[3]，但滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲過程的表觀遺傳學(xué)研究依舊存

3、在很多空白。究竟還有哪些基因受到表觀修飾調(diào)控參與了滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲過程，調(diào)控表觀修飾過程的關(guān)鍵酶，如：DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferasos，DNMTs)等在滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲中作用如何，目前均知之甚少。本研究以此為出發(fā)點(diǎn)，從表觀遺傳角度，探索DNMTS表達(dá)和DNA甲基化修飾在滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲中的調(diào)控作用，實(shí)驗(yàn)獲得了如下結(jié)果：
　　1.免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)分析不同DNMTs在不同分化類型滋養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)分布，結(jié)果顯示：正常

4、胚胎絨毛中DNMT1在合體滋養(yǎng)細(xì)胞(STBs)中度表達(dá)，細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞(CTBs)低表達(dá)；DNMT3A在STBs低表達(dá)，CTBs高度表達(dá)；DNMT3B在STBs中度表達(dá)，CTBs中低表達(dá)。分化和侵襲行為均異常的完全型葡萄胎(complete hydatidiform mole，CHM)組織，DNMT1在STBs高度表達(dá)，CTBs中度表達(dá)。DNMT3A在STBs和CTBs均為中度表達(dá)；DNMT3B在STBs高度表達(dá)，CTBs中度表達(dá)。統(tǒng)計分

5、析顯示，在正常胚胎絨毛中，DNMT1在STBs的表達(dá)較CTBs中高，但無顯著性差異(P=0.12)；DNMT3A在STBs中的表達(dá)遠(yuǎn)低于其在CTBs的表達(dá)，差別具有顯著意義(P<0.01)；DNMT3B在STBs的表達(dá)較CTBs中高，但無顯著性差異(P=0.23)。與正常胚胎絨毛相比：DNMT1(P<0.01)和DNMT3B(P<0.05)在完全型葡萄胎的STBs表達(dá)顯著上調(diào)，DNMT3A表達(dá)下調(diào)，無顯著性意義(P=0.21)；CTBs

6、中DNMT1和DNMT3B表達(dá)上調(diào)但無顯著性意義，DNMT3A表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)。
　　定量PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)分別從mRNA水平和蛋白水平驗(yàn)證了DNMTs在不同類型滋養(yǎng)細(xì)胞(組織)中的表達(dá)模式，即與具備一定分化和侵襲潛力的正常胚胎絨毛相比，幾乎失去分化能力的完全型葡萄胎組織中，DNMT1和DNMT3B的表達(dá)顯著上調(diào)，DNMT3A表達(dá)顯著下調(diào)。上述結(jié)果揭示了不同DNMTs在滋養(yǎng)細(xì)胞分化或侵襲中可能發(fā)揮著不

7、同的作用。
　　2.在不同侵襲能力的體外培養(yǎng)的滋養(yǎng)細(xì)胞中，DNMTs表達(dá)亦具有差異：與具有較強(qiáng)侵襲能力的HTR-8/SVneo細(xì)胞相比，無論在mRNA還是蛋白水平，侵襲能力較低的絨癌來源細(xì)胞JEG-3中DNMT1表達(dá)均無顯著性差異(P=0.15)；DNMT3A表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；DNMT3B表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)。
　　綜合分析DNMTs的表達(dá)模式顯示：在不同侵襲行為滋養(yǎng)細(xì)胞系中，DNMT1的表達(dá)并無顯著差異，但

8、在絨毛和完全型葡萄胎中的表達(dá)有顯著差異；DNMT3A在侵襲能力較強(qiáng)的HTR-8/SVneo細(xì)胞和分化潛力強(qiáng)的胚胎絨毛中高表達(dá)；DNMT3B在侵襲能力較低的JEG-3和分化潛力較弱的完全型葡萄胎中高表達(dá)，說明DNMTs可能是影響滋養(yǎng)細(xì)胞分化和侵襲能力的重要因子，但在功能上有所差異。
　　3.濃度分別為5μm/L和50μm/L的DNMTs抑制劑5-AZA-CdR誘導(dǎo)細(xì)胞，western blot檢測該藥物對DNMTs的表達(dá)抑制，結(jié)果顯

9、示DNMT1無顯著性表達(dá)抑制；DNMT3A的表達(dá)抑制有顯著性(P<0.01)，抑制倍數(shù)分別為0.28和0.26；對DNMT3B表達(dá)抑制亦較為顯著(P<0.05)，抑制倍數(shù)分別為0.62和0.55。相同條件下，5-AZA-CdR對DNMT3A和DNMT3B表達(dá)的抑制能力有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。5-AZA-CdR誘導(dǎo)下，HTR-8/SVneo細(xì)胞侵襲能力降低：藥物處理組穿透細(xì)胞數(shù)量(7.3±1.3個/視野)與對照組穿透細(xì)胞數(shù)量(3

10、6.7±2.9個/視野)相比，有顯著差異(P<0.01)。在調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力方面，DNMT3A顯示出比DNMT1和DNMT3B更為重要的作用。
　　4.5-AZA-CdR誘導(dǎo)下，不同滋養(yǎng)細(xì)胞系在形態(tài)學(xué)改變、凋亡誘導(dǎo)等方面亦有所差異：HTR-8/SVneo細(xì)胞對藥物誘導(dǎo)顯示出一定的抵抗能力，JEG-3細(xì)胞則更為敏感。相同濃度和處理時間下，JEG-3細(xì)胞較HTR-8/SVneo細(xì)胞皺縮、變圓、及死亡脫落更為明顯。JEG-3細(xì)胞凋亡

11、數(shù)量(24.57±1.4％)高于HTR-8/SVneo細(xì)胞凋亡數(shù)量(10.23±1.04％)，藥物誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞數(shù)量在兩種細(xì)胞間具有顯著差異(p<0.05)。說明DNMTs在不同滋養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)可影響細(xì)胞對DNMTs抑制劑的敏感性。
　　5.MeDIP-chip實(shí)驗(yàn)共發(fā)現(xiàn)8146個甲基化位點(diǎn)，其中正常胚胎絨毛，完全型葡萄胎，HTR-8/SVneo和JEG-3細(xì)胞系的啟動子甲基化位點(diǎn)分別為4264個，4356個，6712和6395個

12、(PeakScore≥2.0)，在22條常染色體和X染色體上均有分布。異常侵襲行為滋養(yǎng)細(xì)胞(完全型葡萄胎和絨癌)中甲基化，而同時在正常滋養(yǎng)細(xì)胞(正常胚胎絨毛和HTR-8)中非甲基化的位點(diǎn)涉及基因118個。正常滋養(yǎng)細(xì)胞(正常胚胎絨毛和HTR-8/SVneo)中甲基化、異常侵襲行為滋養(yǎng)細(xì)胞(完全型葡萄胎和絨癌)中同時為非甲基化的基因位點(diǎn)涉及基因88個。DAVID軟件功能分類結(jié)果顯示，存在差異甲基化位點(diǎn)的基因主要與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，磷脂的轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)

13、胞骨架組成，細(xì)胞周期，生殖過程等相關(guān)。
　　6.MeDIP-chip實(shí)驗(yàn)所發(fā)現(xiàn)的差異甲基化基因，腫瘤蛋白D52(TPD52)、鈣粘附蛋白(CDH1)、層粘連蛋白(LAMA4)等在不同滋養(yǎng)細(xì)胞系的差異甲基化模式被甲基化特異性PCR(MSP)證實(shí)；TPD52和CDH1的差異甲基化模式進(jìn)一步被甲基化測序(BSP)實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。RT-PCR顯示，與JEG-3和JAR細(xì)胞相比，TPD52和CDH1基因的表達(dá)在HTR-8/SVneo細(xì)胞中受到了