妊娠早期葉酸缺乏對(duì)仔豬骨骼肌mRNA表達(dá)譜的影響及其表觀遺傳機(jī)制研究.pdf

1、孕期葉酸缺乏(folate deficiency, FD)能夠引起胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩(intrauterine growthretardation，IUGR)，而骨骼肌發(fā)育不良是IUGR的主要表征。然而，葉酸缺乏對(duì)骨骼肌發(fā)育的影響及其分子機(jī)制還不明確。近年來(lái)，提高肉質(zhì)水平已成為21世紀(jì)養(yǎng)豬業(yè)及育種專家新的攻關(guān)方向;在人類孕前孕后補(bǔ)充葉酸對(duì)后代的長(zhǎng)遠(yuǎn)影響已受到專家的質(zhì)疑并將成為新的研究熱點(diǎn)。本研究探討葉酸的缺乏及補(bǔ)充對(duì)骨骼肌形成及發(fā)育的影響

2、，旨在為肉質(zhì)改善和臨床葉酸營(yíng)養(yǎng)提供有力的實(shí)驗(yàn)支持。首先，我們以豬為動(dòng)物模型，觀察孕早期葉酸缺乏對(duì)仔豬骨骼肌性狀及mRNA表達(dá)譜的影響。在我們的研究中，全同胞關(guān)系的長(zhǎng)白豬與萊蕪豬作為雜交體系，在懷孕0-6個(gè)月喂養(yǎng)葉酸缺乏飼料或正常飼料，觀察初生仔豬背最長(zhǎng)肌(Longissimus dorsi，LD)性狀并收集標(biāo)本，用4×44K Agilent豬芯片進(jìn)行表達(dá)譜檢測(cè)。無(wú)論在正交組（LR♂×LW♀）還是反交組（LW♂×LR♀），葉酸缺乏組出生仔

3、豬體重均低于正常對(duì)照組，而對(duì)仔豬體長(zhǎng)體高無(wú)顯著影響;葉酸缺乏組仔豬肌纖維密度降低，LD中甘油三酯含量更高。芯片結(jié)果顯示在LR♂×LW♀葉酸缺乏組與對(duì)照組比較，子代LD中有3154個(gè)基因差異表達(dá)，而反交組有3885個(gè)差異基因（differentially expressed genes，DEGs）;結(jié)果還表明在正反交之間葉酸主要通過(guò)影響不同的差異基因而發(fā)揮作用。功能分析表明，孕期母豬葉酸缺乏影響了仔豬LD中幾乎所有的生物學(xué)過(guò)程;GO與KE

4、GG篩查出脂肪發(fā)育及脂代謝相關(guān)的基因與通路，說(shuō)明母豬葉酸缺乏可能通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因而影響了仔豬的脂肪沉積。
　　另一方面，C2C12細(xì)胞株在低血清誘導(dǎo)條件下能夠分化為多核的肌管，是體外研究成肌細(xì)胞增殖和分化的首選模型。我們以C2C12為模型，分別研究葉酸對(duì)成肌細(xì)胞增殖及分化的影響并探討其可能的機(jī)制。C2C12培養(yǎng)于乏葉酸培養(yǎng)基D2429中來(lái)觀察葉酸對(duì)肌形成的影響。根據(jù)葉酸濃度分成三個(gè)組:葉酸缺乏組(Folate-0mg/l，L)，正

5、常葉酸濃度組(Folate-4mg/l，N)及高葉酸濃度葉酸組(Folate-40mg/l，H)。我們首先研究葉酸對(duì)C2C12增殖及分化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葉酸缺乏能夠促進(jìn)C2C12細(xì)胞增殖而抑制其分化，而高濃度葉酸能促進(jìn)C2C12的增殖及分化。在C2C12增殖過(guò)程中，正常組MyoD mRNA表達(dá)明顯高于葉酸缺乏與高濃度葉酸組(P＜0.05)。通過(guò)亞硫酸鹽測(cè)序（bisulphite sequencing，BS）發(fā)現(xiàn)MyoD轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（Tr

6、anscription start site，TSS）上游-16bp to+26bp中的5個(gè)CpG位點(diǎn)在H組高甲基化，在N組低甲基化。在C2C12分化過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)隨著葉酸濃度的升高M(jìn)yogenin mRNA表達(dá)增強(qiáng);在檢測(cè)的-374bpto+6bp380bp中，靠近TSS的第7和第8 CpG位點(diǎn)在高H組高甲基化，而在L組第5和第9位點(diǎn)高甲基化，在L組第2、3、4位點(diǎn)高甲基化;Myogenin第一外顯子區(qū)甲基化情況在三組之間沒(méi)有明顯不

7、同。葉酸可能正是通過(guò)影響基因啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)甲基化情況而影響MyoD和Myogenin的表達(dá)。
　　我們進(jìn)一步利用MeDIP-chip技術(shù)檢測(cè)了葉酸對(duì)C2C12分化過(guò)程中全基因組甲基化的影響。結(jié)果表明每?jī)山M之間啟動(dòng)子區(qū)和CpG島區(qū)都存在大量差異甲基化區(qū)域（differentially methylated regions，DMRs）。啟動(dòng)子區(qū)的DMRs又根據(jù)CpG含量分為HCP、ICP及LCP，在各組之間DMRs主要是HCP;各

8、組之間CpG島中的DMRs主要位于啟動(dòng)子區(qū)CpG島中。在NvsL之間啟動(dòng)子區(qū)共有180 DMRs(84 hypermethylatedand96 hypomethylated)，在HvsL之間共有199 DMRs(95 hypermethylated and104hypomethylated)，在HvsN之間共有201 DMRs(104 hypermethylated and97hypomethylated)。在甲基化譜中NvsL與Hv

9、sL存在較多的common DMRs;而無(wú)論是甲基化上調(diào)還是甲基化下調(diào)的DMRs比較，Nvs L與HvsL之間common DMRs均較少。對(duì)DMRs所在基因進(jìn)行功能分析表明NvsL的DMRs主要富集于細(xì)胞分化及發(fā)育過(guò)程，而Hvs L的DMRs更多富集于細(xì)胞周期及各種細(xì)胞代謝過(guò)程。說(shuō)明從葉酸缺乏狀態(tài)補(bǔ)充到正常葉酸濃度狀態(tài)，與從正常葉酸濃度補(bǔ)充到高濃度葉酸狀態(tài)是通過(guò)調(diào)控不同基因甲基化狀態(tài)及不同的生物學(xué)過(guò)程而影響C2C12的分化。對(duì)甲基化譜

10、及表達(dá)譜關(guān)聯(lián)分析表明，DMRs與DEGs之間存在一些關(guān)聯(lián)基因，也就是說(shuō)在C2C12分化過(guò)程中，不同濃度葉酸對(duì)基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的影響可能是一些基因差異表達(dá)的直接原因;另一方面，我們可以看出兩組之間的DMRs并不是DEGs的唯一原因，即在不同濃度葉酸條件下引起的基因差異表達(dá)是各種調(diào)控綜合作用的結(jié)果。
　　總之，本研究結(jié)果顯示孕期葉酸缺乏能夠改變仔豬背最長(zhǎng)肌的基因表達(dá)從而影響仔豬骨骼肌的形成，并且母豬葉酸缺乏能夠影響仔豬的脂肪沉積。另