禽類病原體抗原在蘇云金芽胞桿菌細(xì)胞表面的展示.pdf

1、本研究在國(guó)內(nèi)外首次利用來(lái)自蘇云金芽胞桿菌的S-層蛋白在蘇云金芽胞桿菌細(xì)胞表面成功展示了禽流感病毒核衣殼蛋白NP和血凝素蛋白HA1以及雞毒霉形體粘附素蛋白pMGA等禽類病原體抗原，從而為用蘇云金芽胞桿菌投遞病原體抗原來(lái)研制熱穩(wěn)定性禽用口服疫苗探明了科學(xué)道路。 1.檢測(cè)S-層表面展示系統(tǒng)中的受體菌株及載體質(zhì)粒對(duì)小鼠和雛雞的安全性 為了檢測(cè)展示系統(tǒng)中的受體菌株蘇云金芽胞桿菌無(wú)晶體突變株BMB171和載體質(zhì)粒pHT304的安全性

2、，將質(zhì)粒pHT304電轉(zhuǎn)化入BMB171中，得到菌株BMB304。以BMB304作為受試菌株，對(duì)小鼠和雛雞進(jìn)行安全性測(cè)試，并考察BMB304在雞腸道中的存留情況，以探索用蘇云金芽胞桿菌無(wú)晶體突變株作為外源抗原的載體以研制疫苗的可行性。 小鼠腹腔一次性注射含10<'10>BMB304 營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞液1.0mL，觀察14天，未發(fā)現(xiàn)有急性毒性反應(yīng)。小鼠飲用含10<'8>、10<'7>和10<'6>BMB304營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞/mL的飲用水28天，

3、各組小鼠精神和飲食正常，病理解剖學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)異常變化，各劑量組小鼠體重變化、臟器系數(shù)、血常規(guī)指標(biāo)及血液生化指標(biāo)與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異。雛雞24小時(shí)內(nèi)灌服含10<'10>BMB304芽胞液1.0mL，14天內(nèi)未出現(xiàn)急性毒性反應(yīng)。飼喂雛雞含10<'8>、10<'8>和10<'6> BMB304芽胞/g飼料28天，雛雞精神和飲食正常，病理解剖學(xué)檢查未見(jiàn)任何異常，各劑量組的日增重與對(duì)照組相比差異不顯著。飼喂雛雞含 10<'6>BMB304芽胞

4、/g飼料3天后，經(jīng)測(cè)定，芽胞能在雞腸道中萌發(fā)并至少存留5天但不超過(guò)7天。結(jié)果表明，受體菌株BMB171和載體質(zhì)粒pHT304對(duì)小鼠和雛雞安全無(wú)毒，且能在雞腸道內(nèi)暫時(shí)定殖，能作為外源抗原的載體以研制疫苗之用。 2.構(gòu)建含禽類病原體抗原基因的S-層融合蛋白基因 通過(guò)PCR擴(kuò)增分別得到欲展示的病原體抗原基因np、npp、ha1p和pmga1.2p。用抗原基因片段替換S-層蛋白 ctc 基因表面錨定序列slh下游的3’-端或中部

5、片段，分別獲得了2個(gè)含 np 基因的重組質(zhì)粒pSNP和pCSA-SNP；2個(gè)含npp基因的重組質(zhì)粒pCTC-NPP和pCSNPP；2個(gè)含ha1p基因的重組質(zhì)粒pCTC-HA1P和pCSHA1P；2個(gè)含 pmga1.2p 基因的重組質(zhì)粒 pCTC-PMGA1.2P和pCSPMGA1.2P。其中在構(gòu)建pCSA-SNP、pCSNPP、pCSHA1P和pCSPMGA1.2P這4個(gè)重組質(zhì)粒時(shí)，在S-層融合蛋白基因的上游插入了 csaAB操縱元，c

6、saAB操縱元對(duì)S-層蛋白錨定到細(xì)胞表面起重要作用。 3.構(gòu)建含S-層融合蛋白基因的重組菌株 將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入受體菌株BMB171中，分別獲得了5個(gè)展示NP蛋白的重組菌株BN(含pSNP)、BCN(含pSNP和pMIL-CSA)、C-S(含pCSA-SNP)、BCCN(含pCTC-NPP和pMIL-CSA)和CN(含 pCSNPP)；2個(gè)展示 HA1 蛋白的重組菌株BCCH(含pCTC-HA1P和pMIL-CSA)和C

7、H(含pCSHA1P)；2個(gè)展示pMGA蛋白的重組菌株BCCG(含pCTC-PMGA1.2P和pMIL-CSA)和CG(含pCSPMGA1.2P)。其中質(zhì)粒pMIL-CSA攜帶有csaAB操縱元，在轉(zhuǎn)化不含csaAB操縱元的重組質(zhì)粒時(shí)要同時(shí)轉(zhuǎn)化該質(zhì)粒，以便給受體菌株提供csaAB操縱元。 4.檢測(cè)外源抗原蛋白在重組菌株細(xì)胞表面的展示情況 用玻片凝集試驗(yàn)檢測(cè)5個(gè)展示NP蛋白的重組菌株的表面展示情況，用血凝和血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)

8、2個(gè)展示HA1蛋白和2個(gè)展示pMGA蛋白的重組菌株的表面展示情況。結(jié)果，所有的重組菌株均表現(xiàn)出了預(yù)計(jì)的生物學(xué)活性，說(shuō)明所構(gòu)建的S-層融合蛋白基因在受體菌株中得到表達(dá)并展示到了細(xì)胞表面且具有活性。 5.檢測(cè)重組菌株對(duì)小鼠和雛雞的免疫原性 用9個(gè)重組菌株的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞分別通過(guò)腹腔注射途徑免疫SPF級(jí)BALB/c小白鼠，用間接ELISA測(cè)定小白鼠血清抗體效價(jià)。結(jié)果，小鼠產(chǎn)生了針對(duì)相應(yīng)外源抗原的抗體，其抗體水平與作為對(duì)照的受體菌株B

9、MB171相比差異極顯著，說(shuō)明所構(gòu)建的重組菌株具有免疫原性。 將展示HA1蛋白的重組菌株BCCH和CH以及展示pMGA蛋白的重組菌株BCCG和CG培養(yǎng)至芽胞形成期，用重組菌株的芽胞液通過(guò)口服途徑免疫艾維因商品代肉雛雞，用血凝抑制試驗(yàn)測(cè)定接種BCCH和CH的雞的血清抗體效價(jià)，用血清平板凝集試驗(yàn)測(cè)定接種BCCG和CG的雞的血清抗體效價(jià)。結(jié)果，實(shí)驗(yàn)雞產(chǎn)生了針對(duì)相應(yīng)外源抗原的抗體，其抗體水平與作為對(duì)照的受體菌株BMB171相比差異極顯著