miRNA與肺動脈高壓的相關性和高原自噬對心肌缺血再灌注的影響.pdf

1、第一部分:microRNA在左向右分流性肺動脈高壓大鼠肺組織中的表達
　　肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是指靜息狀態(tài)下用右心導管(RHC)測得的平均肺動脈壓(mPAP)至少高于25mmHg的一種復雜病理生理綜合征。肺動脈高壓既可以是原發(fā)性的，也可以是繼發(fā)于其它一些疾病。肺動脈高壓包括肺內(nèi)或與肺相關血管的收縮緊縮，這使得心臟很難向肺供血。長久以往，受影響的血管就會形成纖維化，進而

2、繼續(xù)升高肺內(nèi)的血管壓力和影響血流量。此外，心臟增加的工作負荷會使得右心室肥厚，以至于心臟無法將血泵入肺內(nèi)，最終引起右心力衰竭。血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞和基質(zhì)細胞等細胞都參與到了PAH的發(fā)展過程。左向右分流性肺動脈高壓是一種最常見的肺動脈高壓。左向右的分流會引起肺血管流量和壓力的持續(xù)增高，導致內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞異常增生，使得肺血管重構，最終形成肺動脈高壓。
　　microRNA(miRNA)是一類僅由18-25個核苷酸

3、構成的單鏈小分子RNA，廣泛存在于真核生物中。其通過對特定靶基因mRNA的翻譯過程起抑制或直接降解mRNA發(fā)揮作用。目前已知miRNA幾乎參與了各種病理生理過程，并發(fā)揮重要作用。但是它在肺動脈高壓發(fā)生發(fā)展過程中的作用卻鮮有報道。
　　本課題以左向右分流性肺動脈高壓大鼠模型為主要研究對象，初步研究miRNAs與肺動脈高壓發(fā)生發(fā)展的相關性，并預測與肺動脈高壓相關的靶基因位點，為深入探討應用miRNAs靶向治療肺動脈高壓提供理論依據(jù)。<

4、br>　　方法
　　1.左向右分流性肺動脈高壓大鼠模型的建立
　　(1)運用頸動靜脈分流術建立左向右分流性肺動脈高壓大鼠模型。
　　(2)在相應時相點檢測分流組和對照組大鼠的平均肺動脈壓(mPAP)和右心室肥厚指數(shù)(RVHI)。
　　(3)取大鼠肺組織，行HE染色觀察肺小動脈形態(tài)變化。
　　2.應用芯片檢測技術，分析肺動脈高壓形成后miRNAs表達譜的變化
　　(1)應用微陣列芯片技術，檢測差異性表達

5、的miRNAs。
　　(2)應用RT-PCR技術驗證明顯差異性表達的miRNAs。
　　3.應用靶基因預測軟件預測差異性表達的miRNAs所調(diào)控的與肺動脈高壓相關的靶基因。
　　結果
　　1.成功構建大鼠左向右分流性肺動脈高壓大鼠模型，且與對照組相比，分流組大鼠的肺動脈收縮壓(PASP)和右心室肥厚指數(shù)(RVHI)增高。HE染色顯示分流組肺小動脈血管壁增厚，管腔狹窄。
　　2.芯片結果顯示，在肺動脈高壓大鼠

6、中有89種miRNA上調(diào)，20種miRNA下調(diào)。上調(diào)的miRNA包括miR-130b、miR-98和miR-193等等。下調(diào)的miRNA包括miR-127、miR-379和miR-541等等。對其中差異性最明顯的miR-130b、miR-127和miR-98，用RT-PCR技術進行了驗證。
　　3.運用靶基因預測軟件，得到miR-98和miR-130b的預測下游靶基因包括Yod1，Edn1, PPARG, HSP40, Esm1。

7、
　　結論:
　　1.運用套管法連接大鼠頸總動脈和頸外靜脈，可形成持續(xù)的低流量體肺分流，誘導肺血管重構，進而形成左向右分流性肺動脈高壓。
　　2.在肺動脈高壓大鼠模型中存在明顯差異性表達的miRNAs，并且可以通過RT-PCR技術進行驗證。miRNA在肺動脈高壓的形成過程中可能起重要作用，而預測出的靶基因包括Yod1，Edn1，PPARG，HSP40，Esm1。
　　第二部分:高原患兒Bnip3與自噬水平對心肌缺

8、血再灌注損傷的影響研究
　　高原先天性心臟病的發(fā)病率大概為1.37％，是平原人群的2到3倍。2005年中國人口普查發(fā)現(xiàn)，藏族人群總數(shù)為5，416，021，大部分生活在海拔3000米以上。因此有很多患有先天性心臟病的藏族人需要接受心臟手術。由于醫(yī)療衛(wèi)生水平的改善和更便捷的交通，青藏高原越來越多的先天性心臟病患者得到了去平原心臟中心接受心臟手術的機會。然而，關于高原病人心臟手術期間心肌缺血再灌注損傷的報道卻很少。
　　青藏高原居

9、民的平均動脈氧分壓大概為57mmHg。目前已肯定慢性缺氧能夠提高Bnip3的表達，而Bnip3能夠通過抑制雷帕霉素靶蛋白來提高自噬水平。自噬是細胞內(nèi)的一種自體降解過程，也就是細胞內(nèi)的衰老的蛋白質(zhì)和細胞器被降解和回收的過程。平時自噬保持基線水平，但在應激條件下，例如養(yǎng)分耗竭或者缺氧，會進一步被誘導升高。高水平自噬可以使得青藏高原居民適應高海拔環(huán)境并耐受缺氧。
　　體外和體內(nèi)試驗研究表明自噬在心肌缺血再灌注損傷中起重要作用，提高自噬能

10、力可以保護心肌免受缺血再灌注損傷。特別是自噬的基礎水平對維持細胞穩(wěn)態(tài)和保護細胞對抗功能紊亂的細胞器具有重要作用。然而，關于人類的這方面臨床報道甚少。
　　基于以上情況，我們推測西藏的先天性心臟病患者比平原患者能夠更好的抵抗心臟手術中的心肌缺血再灌注損傷，這是由于長期的慢性缺氧導致他們具有更高的基礎自噬水平。為了驗證這一假設，我們研究了接受心臟手術的高原患兒和平原患兒基礎自噬水平以及其上游與缺氧相關的蛋白Bnip3的變化，以探討自噬

11、水平對心肌缺血再灌注損傷的影響。
　　方法:
　　1.高原組和平原組患者的入選標準（入選標準包括患者年齡，性別，民族，疾病類型等）
　　2.高原組和平原組的心肌缺血再灌注損傷程度的比較
　　(1)檢測比較兩組心肌肌鈣蛋白的變化。
　　(2)檢測比較兩組腦鈉肽的變化。
　　(3)應用HE染色技術，檢測兩組心肌病變情況。
　　(4)應用TUNEL染色技術，檢測兩組心肌病變情況。
　　(5)應用

12、透射電鏡技術，檢測兩組心肌病變情況。
　　3.利用Westem Blot來評價自噬相關蛋白LC3Ⅱ，Beclin1和LAMP2以及它們的上游蛋白Bnip3。
　　(1)利用Western Blot來評價自噬相關蛋白LC3Ⅱ，Beclin1和LAMP2水平的變化。
　　(2)利用Western Blot來評價上游蛋白Bnip3水平的變化。
　　結果:
　　1.12名長期居住在青藏高原的藏族患者（海拔＞3000

13、m）與12名長期居住在平原的患者（海拔＜500m）成功入選本研究。
　　2.高原組術后6小時的心肌肌鈣蛋白濃度，腦鈉肽增長速度以及術后凋亡比明顯低于平原組。平原組心房組織的心肌病理改變比高原組嚴重。
　　3.無論是術前還是術后的LC3Ⅱ，LAMP2以及上游的Bnip3水平，高原組都明顯高于平原組(P＜0.05)。而缺血再灌注后Beclin1的水平在高原組和平原組無明顯差異性（P＞0.05）。
　　結論:
　　高原