轉(zhuǎn)錄抑制LPL表達的ZHX2蛋白功能域的鑒定.pdf

1、本文從以下幾個方面進行論述：
　　第一部分 轉(zhuǎn)錄抑制LPL表達的ZHX2蛋白功能域的鑒定
　　研究目的：
　　1.構(gòu)建包含不同功能域的ZHX2表達質(zhì)粒，檢測對LPL表達的影響，篩選出能抑制LPL表達的ZHX2蛋白功能域。
　　2.檢測全長或截短型ZHX2蛋白對LPL核心啟動子活性的影響，進一步驗證ZHX2關(guān)鍵功能域的轉(zhuǎn)錄抑制活性。
　　研究方法：
　　1.截短型ZHX2表達載體的構(gòu)建
　　根據(jù)已

2、有文獻報道，ZHX2同源結(jié)構(gòu)域4，5沒有明確的抑制功能。本實驗室之前已構(gòu)建ZHX2鋅指結(jié)構(gòu)域1至同源結(jié)構(gòu)域2、同源結(jié)構(gòu)域1至同源結(jié)構(gòu)域2、同源結(jié)構(gòu)域1三種截短體質(zhì)粒。在此基礎(chǔ)上，本課題進一步構(gòu)建了ZHX2同源結(jié)構(gòu)域1至部分脯氨酸富含區(qū)242-439aa及242-446aa的截短體質(zhì)粒，酶切和測序驗證載體是否構(gòu)建成功。
　　2.抑制LPL表達的ZHX2功能域的篩選
　　在肝癌細胞系SMMC7721及HepG2中，轉(zhuǎn)染ZHX2全

3、長及各個截短體質(zhì)粒。48小時后收RNA。RT-PCR檢測LPL mRNA水平的變化。
　　3.驗證ZHX2對LPL核心啟動子的調(diào)控作用
　　將LPL核心啟動子報告質(zhì)粒分別與ZHX2全長及上述篩選出的、抑制LPL表達的ZHX2功能域過表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入HEK293細胞中，以pRL-TK質(zhì)粒為內(nèi)參。48小時后收蛋白，雙熒光檢測ZHX2對LPL核心啟動子的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1.截短型ZHX2表達質(zhì)粒的構(gòu)建和驗證<

4、br>　　以pcDNA3質(zhì)粒為骨架，在多克隆位點處的酶切位點EcoRⅠ與KpnⅠ之間插入編碼不同長度ZHX2截短體ZHX2(242-439aa)、ZHX2的序列，T4連接酶連接粘性末端處的缺口，雙酶切實驗初步驗證載體構(gòu)建成功，最后測序確保構(gòu)建載體的正確性。
　　2.ZHX2是轉(zhuǎn)錄抑制LPL表達的較小功能域在肝癌細胞系SMMC7721及HepG2中過表達ZHX2全長及包含不同功能域的截短體質(zhì)粒，RT-PCR結(jié)果表明，與pcDNA3對

5、照組相比，除了ZHX2全長的質(zhì)粒具有抑制LPL表達的功能外，含鋅指結(jié)構(gòu)域1至同源結(jié)構(gòu)域2、同源結(jié)構(gòu)域1至同源結(jié)構(gòu)域2、同源結(jié)構(gòu)域1及部分脯氨酸富含區(qū)區(qū)域仍有抑制功能;但同源結(jié)構(gòu)域1至部分脯氨酸富含區(qū)及同源結(jié)構(gòu)域1的截短體質(zhì)粒抑制功能消失。因此，ZHX2是轉(zhuǎn)錄抑制表達的較小功能區(qū)。
　　3.ZHX2可抑制LPL核心啟動子的活性將ZHX2全長或242-446aa片段的表達質(zhì)粒與LPL核心啟動子共同轉(zhuǎn)染入HEK293細胞中，雙熒光素酶實

6、驗檢測啟動子活性。結(jié)果顯示，與對照組相比，ZHX2區(qū)域及ZHX2全長對于LPL的核心啟動子均有抑制作用，進一步證實了ZHX2對LPL表達的轉(zhuǎn)錄抑制作用。
　　研究結(jié)論與意義:
　　1.ZHX2可以從轉(zhuǎn)錄水平抑制LPL啟動子的表達，ZHX2(242-446aa)是抑制LPL表達的較小功能域。
　　2.LPL是體內(nèi)分解甘油三酯的限速酶，與動脈粥樣硬化、糖尿病等多種代謝相關(guān)疾病關(guān)系密切。研究ZHX2對LPL的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，為

7、了解脂質(zhì)代謝相關(guān)疾病的發(fā)病機制，臨床治療肥胖、動脈粥樣硬化等疾病提供新的思路。
　　第二部分 ZHX2在急性肝炎中的作用及其對巨噬細胞活化的影響
　　研究目的：
　　1.利用肝炎動物模型，檢測ZHX2在肝組織中的表達變化，初步研究其在急性肝炎發(fā)病中的作用。
　　2.ZHX2在巨噬細胞中的表達及其對巨噬細胞活化的調(diào)控作用。
　　研究方法：
　　1.急性肝炎小鼠肝組織中的ZHX2表達變化
　　1.1

8、ConA肝炎模型的建立
　　6～8周的雄性C57BL/6小鼠，分為兩組，每組4只，實驗組尾靜脈注射ConA，對照組尾靜脈注射PBS。8h后，處死小鼠，留取血清，檢測ALT水平。留取肝組織，提取RNA，RT-PCR檢測ZHX2表達的變化。
　　1.2 LPS/GalN肝炎模型的建立
　　6～8周的雄性C57BL/6小鼠腹腔注射LPS/GaIN，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生急性肝炎。對照組小鼠腹腔注射等量PBS。5h后，留取血清，檢測血清

9、ALT水平。取肝組織，RT-PCR檢測實驗組與對照組小鼠ZHX2表達水平的變化。
　　2.ZHX2過表達對ConA誘導(dǎo)小鼠急性肝炎的影響
　　為了避免尾靜脈高壓注射對小鼠肝臟造成的損傷，課題組利用體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑PEI攜載質(zhì)粒的方法在小鼠體內(nèi)過表達ZHX2。6～8周雄性C57BL/6小鼠，實驗組尾靜脈注射PEI與pcZHX2-HA質(zhì)?；旌衔铮瑢φ战M注射pcDNA3質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后48h，尾靜脈注射ConA誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生急性肝炎。6h后

10、摘眼球取血處死小鼠，取血清測ALT水平。取部分肝組織以4％多聚甲醛固定，制備石蠟切片，用于HE染色進一步觀察肝組織壞死及炎性細胞浸潤情況以及TUNEL染色觀察肝細胞凋亡情況。另取部分肝組織用于提取組織蛋白和RNA，Western blot檢測肝組織中ZHX2過表達水平，檢測凋亡相關(guān)分子的表達。剩余肝組織用于提取肝單個核細胞。RT-PCR檢測肝單個核細胞中ZHX2和炎性細胞因子的表達情況。
　　3.ZHX2在巨噬細胞中的表達及其對巨

11、噬細胞活化的調(diào)控作用
　　3.1ConA及LPS刺激對巨噬細胞中ZHX2表達的影響
　　以不同劑量的ConA或LPS分別刺激淀粉誘導(dǎo)的腹腔巨噬細胞，或以同一劑量刺激不同時間點。收細胞，提取總RNA。RT-PCR檢測ZHX2及促炎細胞因子的表達變化。
　　3.2巨噬細胞中的ZHX2對炎性細胞因子表達的影響
　　為了進一步明確ZHX2在巨噬細胞活化中調(diào)控作用，我們以淀粉誘導(dǎo)的腹腔巨噬細胞或骨髓來源的巨噬細胞為研究對象

12、。轉(zhuǎn)染ZHX2特異性小干擾，以NCsiRNA為陰性對照，轉(zhuǎn)染48h后分別用不同劑量的LPS刺激后，6小時后收細胞，提取總RNA，以RT-PCR檢測干擾ZHX2后促炎細胞因子的表達變化。
　　研究結(jié)果：
　　1.ZHX2在急性肝炎中表達上調(diào)
　　1.1ConA誘導(dǎo)肝炎的肝組織中ZHX2表達上調(diào)
　　用ConA誘導(dǎo)C57BL/6小鼠產(chǎn)生急性肝炎，8h后處死小鼠，血清ALT水平檢測結(jié)果顯示，與PBS對照組相比，ConA

13、誘導(dǎo)后的小鼠血清ALT水平明顯升高，說明肝炎模型誘導(dǎo)成功。RT-PCR檢測肝組織中ZHX2的表達，結(jié)果顯示，與PBS對照組小鼠相比，ConA模型組小鼠肝組織中ZHX2表達水平同樣明顯升高。
　　1.2 LPS/GalN肝炎模型肝組織中的ZHX2表達上調(diào)
　　用LPS/GalN誘導(dǎo)C57BL/6小鼠產(chǎn)生急性肝炎，5h后處死小鼠，血清ALT水平檢測結(jié)果顯示，LPS/GalN誘導(dǎo)肝炎小鼠血清ALT水平明顯高于PBS對照組。RT-P

14、CR結(jié)果顯示，LPS/GalN誘導(dǎo)肝炎小鼠肝組織中ZHX2表達水平顯著高于PBS對照組小鼠。
　　2.ZHX2過表達加重ConA誘導(dǎo)的小鼠肝損傷
　　利用PEI攜載ZHX2質(zhì)粒，通過尾靜脈注射在C57BL/6小鼠肝臟中過表達ZHX2。48h后用低劑量的ConA誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生急性肝炎，6h后處死小鼠，檢測小鼠血清ALT水平。結(jié)果表明，過表達ZHX2組小鼠ALT水平高于pcDNA3組，提示過表達ZHX2后，小鼠肝組織損傷加重。組織

15、切片HE染色結(jié)果顯示，與pcDNA3注射組小鼠相比，ZHX2過表達組的小鼠肝組織中存在大量肝細胞變性壞死、組織充血，炎性細胞的浸潤也更為嚴(yán)重。TUNEL染色結(jié)果顯示，ZHX2過表達組小鼠肝組織中TUNEL染色陽性的凋亡細胞數(shù)目明顯多于pcDNA3組。肝單個核細胞及肝組織RT-PCR檢測結(jié)果顯示，過表達ZHX2組小鼠促炎細胞因子IL-1β的表達顯著高于pcDNA3對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義而IFN-γ、TNF-α和iNOS的表達水平亦具有

16、升高的趨勢。以上結(jié)果提示，ZHX2過表達可加重ConA誘導(dǎo)的肝損傷并促進炎性細胞因子的分泌。
　　3.ZHX2在巨噬細胞中表達及其對巨噬細胞活化的調(diào)控作用
　　3.1LPS及ConA刺激上調(diào)腹腔巨噬細胞中ZHX2的表達
　　以不同劑量ConA刺激腹腔巨噬細胞，或以同一劑量ConA刺激不同的時間點，檢測巨噬細胞中ZHX2表達變化。RT-PCR結(jié)果顯示，ConA可誘導(dǎo)巨噬細胞中ZHX2的表達，而炎性因子IL-1β、IL-6

17、的表達沒有變化。以不同劑量LPS刺激腹腔巨噬細胞，或同一劑量LPS刺激不同的時間點，RT-PCR檢測細胞中ZHX2表達變化，結(jié)果顯示ZHX2表達明顯上調(diào)，同時伴隨炎性因子IL-1β、IL-6表達的上調(diào)。
　　3.2 ZHX2小干擾可抑制巨噬細胞炎性因子的分泌
　　利用ZHX2 siRNA敲低小鼠腹腔來源巨噬細胞或骨髓來源巨噬細胞中ZHX2的表達，然后以不同劑量的LPS刺激，RT-PCR檢測ZHX2及炎性細胞因子的表達。結(jié)果顯

18、示，siRNA封閉ZHX2的表達后，炎性細胞因子TNF-α、IL-6及iNOS與對照組相比表達水平有下調(diào)的趨勢。以上結(jié)果初步提示，ZHX2可調(diào)節(jié)巨噬細胞活化后炎性細胞因子的分泌。
　　研究結(jié)論及研究意義：
　　1.ZHX2在炎癥性疾病中的作用尚未見報道，本研究首次證實ZHX2過表達可加重ConA誘導(dǎo)的肝損傷，為ZHX2功能研究提供新的依據(jù)。
　　2.首次發(fā)現(xiàn)炎性刺激可調(diào)節(jié)巨噬細胞中的ZHX2表達，且干擾ZHX2可影響巨