轉(zhuǎn)錄抑制LPL表達(dá)的ZHX2蛋白功能域的鑒定.pdf

1、本文從以下幾個(gè)方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 轉(zhuǎn)錄抑制LPL表達(dá)的ZHX2蛋白功能域的鑒定
　　研究目的：
　　1.構(gòu)建包含不同功能域的ZHX2表達(dá)質(zhì)粒，檢測(cè)對(duì)LPL表達(dá)的影響，篩選出能抑制LPL表達(dá)的ZHX2蛋白功能域。
　　2.檢測(cè)全長(zhǎng)或截短型ZHX2蛋白對(duì)LPL核心啟動(dòng)子活性的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證ZHX2關(guān)鍵功能域的轉(zhuǎn)錄抑制活性。
　　研究方法：
　　1.截短型ZHX2表達(dá)載體的構(gòu)建
　　根據(jù)已

2、有文獻(xiàn)報(bào)道，ZHX2同源結(jié)構(gòu)域4，5沒(méi)有明確的抑制功能。本實(shí)驗(yàn)室之前已構(gòu)建ZHX2鋅指結(jié)構(gòu)域1至同源結(jié)構(gòu)域2、同源結(jié)構(gòu)域1至同源結(jié)構(gòu)域2、同源結(jié)構(gòu)域1三種截短體質(zhì)粒。在此基礎(chǔ)上，本課題進(jìn)一步構(gòu)建了ZHX2同源結(jié)構(gòu)域1至部分脯氨酸富含區(qū)242-439aa及242-446aa的截短體質(zhì)粒，酶切和測(cè)序驗(yàn)證載體是否構(gòu)建成功。
　　2.抑制LPL表達(dá)的ZHX2功能域的篩選
　　在肝癌細(xì)胞系SMMC7721及HepG2中，轉(zhuǎn)染ZHX2全

3、長(zhǎng)及各個(gè)截短體質(zhì)粒。48小時(shí)后收RNA。RT-PCR檢測(cè)LPL mRNA水平的變化。
　　3.驗(yàn)證ZHX2對(duì)LPL核心啟動(dòng)子的調(diào)控作用
　　將LPL核心啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒分別與ZHX2全長(zhǎng)及上述篩選出的、抑制LPL表達(dá)的ZHX2功能域過(guò)表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞中，以pRL-TK質(zhì)粒為內(nèi)參。48小時(shí)后收蛋白，雙熒光檢測(cè)ZHX2對(duì)LPL核心啟動(dòng)子的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1.截短型ZHX2表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和驗(yàn)證<

4、br>　　以pcDNA3質(zhì)粒為骨架，在多克隆位點(diǎn)處的酶切位點(diǎn)EcoRⅠ與KpnⅠ之間插入編碼不同長(zhǎng)度ZHX2截短體ZHX2(242-439aa)、ZHX2的序列，T4連接酶連接粘性末端處的缺口，雙酶切實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證載體構(gòu)建成功，最后測(cè)序確保構(gòu)建載體的正確性。
　　2.ZHX2是轉(zhuǎn)錄抑制LPL表達(dá)的較小功能域在肝癌細(xì)胞系SMMC7721及HepG2中過(guò)表達(dá)ZHX2全長(zhǎng)及包含不同功能域的截短體質(zhì)粒，RT-PCR結(jié)果表明，與pcDNA3對(duì)

5、照組相比，除了ZHX2全長(zhǎng)的質(zhì)粒具有抑制LPL表達(dá)的功能外，含鋅指結(jié)構(gòu)域1至同源結(jié)構(gòu)域2、同源結(jié)構(gòu)域1至同源結(jié)構(gòu)域2、同源結(jié)構(gòu)域1及部分脯氨酸富含區(qū)區(qū)域仍有抑制功能;但同源結(jié)構(gòu)域1至部分脯氨酸富含區(qū)及同源結(jié)構(gòu)域1的截短體質(zhì)粒抑制功能消失。因此，ZHX2是轉(zhuǎn)錄抑制表達(dá)的較小功能區(qū)。
　　3.ZHX2可抑制LPL核心啟動(dòng)子的活性將ZHX2全長(zhǎng)或242-446aa片段的表達(dá)質(zhì)粒與LPL核心啟動(dòng)子共同轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞中，雙熒光素酶實(shí)

6、驗(yàn)檢測(cè)啟動(dòng)子活性。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ZHX2區(qū)域及ZHX2全長(zhǎng)對(duì)于LPL的核心啟動(dòng)子均有抑制作用，進(jìn)一步證實(shí)了ZHX2對(duì)LPL表達(dá)的轉(zhuǎn)錄抑制作用。
　　研究結(jié)論與意義:
　　1.ZHX2可以從轉(zhuǎn)錄水平抑制LPL啟動(dòng)子的表達(dá)，ZHX2(242-446aa)是抑制LPL表達(dá)的較小功能域。
　　2.LPL是體內(nèi)分解甘油三酯的限速酶，與動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病等多種代謝相關(guān)疾病關(guān)系密切。研究ZHX2對(duì)LPL的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，為

7、了解脂質(zhì)代謝相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制，臨床治療肥胖、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病提供新的思路。
　　第二部分 ZHX2在急性肝炎中的作用及其對(duì)巨噬細(xì)胞活化的影響
　　研究目的：
　　1.利用肝炎動(dòng)物模型，檢測(cè)ZHX2在肝組織中的表達(dá)變化，初步研究其在急性肝炎發(fā)病中的作用。
　　2.ZHX2在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)巨噬細(xì)胞活化的調(diào)控作用。
　　研究方法：
　　1.急性肝炎小鼠肝組織中的ZHX2表達(dá)變化
　　1.1

8、ConA肝炎模型的建立
　　6～8周的雄性C57BL/6小鼠，分為兩組，每組4只，實(shí)驗(yàn)組尾靜脈注射ConA，對(duì)照組尾靜脈注射PBS。8h后，處死小鼠，留取血清，檢測(cè)ALT水平。留取肝組織，提取RNA，RT-PCR檢測(cè)ZHX2表達(dá)的變化。
　　1.2 LPS/GalN肝炎模型的建立
　　6～8周的雄性C57BL/6小鼠腹腔注射LPS/GaIN，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生急性肝炎。對(duì)照組小鼠腹腔注射等量PBS。5h后，留取血清，檢測(cè)血清

9、ALT水平。取肝組織，RT-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組小鼠ZHX2表達(dá)水平的變化。
　　2.ZHX2過(guò)表達(dá)對(duì)ConA誘導(dǎo)小鼠急性肝炎的影響
　　為了避免尾靜脈高壓注射對(duì)小鼠肝臟造成的損傷，課題組利用體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑PEI攜載質(zhì)粒的方法在小鼠體內(nèi)過(guò)表達(dá)ZHX2。6～8周雄性C57BL/6小鼠，實(shí)驗(yàn)組尾靜脈注射PEI與pcZHX2-HA質(zhì)粒混合物，對(duì)照組注射pcDNA3質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后48h，尾靜脈注射ConA誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生急性肝炎。6h后

10、摘眼球取血處死小鼠，取血清測(cè)ALT水平。取部分肝組織以4％多聚甲醛固定，制備石蠟切片，用于HE染色進(jìn)一步觀察肝組織壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況以及TUNEL染色觀察肝細(xì)胞凋亡情況。另取部分肝組織用于提取組織蛋白和RNA，Western blot檢測(cè)肝組織中ZHX2過(guò)表達(dá)水平，檢測(cè)凋亡相關(guān)分子的表達(dá)。剩余肝組織用于提取肝單個(gè)核細(xì)胞。RT-PCR檢測(cè)肝單個(gè)核細(xì)胞中ZHX2和炎性細(xì)胞因子的表達(dá)情況。
　　3.ZHX2在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)巨

11、噬細(xì)胞活化的調(diào)控作用
　　3.1ConA及LPS刺激對(duì)巨噬細(xì)胞中ZHX2表達(dá)的影響
　　以不同劑量的ConA或LPS分別刺激淀粉誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞，或以同一劑量刺激不同時(shí)間點(diǎn)。收細(xì)胞，提取總RNA。RT-PCR檢測(cè)ZHX2及促炎細(xì)胞因子的表達(dá)變化。
　　3.2巨噬細(xì)胞中的ZHX2對(duì)炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響
　　為了進(jìn)一步明確ZHX2在巨噬細(xì)胞活化中調(diào)控作用，我們以淀粉誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞或骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象

12、。轉(zhuǎn)染ZHX2特異性小干擾，以NCsiRNA為陰性對(duì)照，轉(zhuǎn)染48h后分別用不同劑量的LPS刺激后，6小時(shí)后收細(xì)胞，提取總RNA，以RT-PCR檢測(cè)干擾ZHX2后促炎細(xì)胞因子的表達(dá)變化。
　　研究結(jié)果：
　　1.ZHX2在急性肝炎中表達(dá)上調(diào)
　　1.1ConA誘導(dǎo)肝炎的肝組織中ZHX2表達(dá)上調(diào)
　　用ConA誘導(dǎo)C57BL/6小鼠產(chǎn)生急性肝炎，8h后處死小鼠，血清ALT水平檢測(cè)結(jié)果顯示，與PBS對(duì)照組相比，ConA

13、誘導(dǎo)后的小鼠血清ALT水平明顯升高，說(shuō)明肝炎模型誘導(dǎo)成功。RT-PCR檢測(cè)肝組織中ZHX2的表達(dá)，結(jié)果顯示，與PBS對(duì)照組小鼠相比，ConA模型組小鼠肝組織中ZHX2表達(dá)水平同樣明顯升高。
　　1.2 LPS/GalN肝炎模型肝組織中的ZHX2表達(dá)上調(diào)
　　用LPS/GalN誘導(dǎo)C57BL/6小鼠產(chǎn)生急性肝炎，5h后處死小鼠，血清ALT水平檢測(cè)結(jié)果顯示，LPS/GalN誘導(dǎo)肝炎小鼠血清ALT水平明顯高于PBS對(duì)照組。RT-P

14、CR結(jié)果顯示，LPS/GalN誘導(dǎo)肝炎小鼠肝組織中ZHX2表達(dá)水平顯著高于PBS對(duì)照組小鼠。
　　2.ZHX2過(guò)表達(dá)加重ConA誘導(dǎo)的小鼠肝損傷
　　利用PEI攜載ZHX2質(zhì)粒，通過(guò)尾靜脈注射在C57BL/6小鼠肝臟中過(guò)表達(dá)ZHX2。48h后用低劑量的ConA誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生急性肝炎，6h后處死小鼠，檢測(cè)小鼠血清ALT水平。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)ZHX2組小鼠ALT水平高于pcDNA3組，提示過(guò)表達(dá)ZHX2后，小鼠肝組織損傷加重。組織

15、切片HE染色結(jié)果顯示，與pcDNA3注射組小鼠相比，ZHX2過(guò)表達(dá)組的小鼠肝組織中存在大量肝細(xì)胞變性壞死、組織充血，炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)也更為嚴(yán)重。TUNEL染色結(jié)果顯示，ZHX2過(guò)表達(dá)組小鼠肝組織中TUNEL染色陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯多于pcDNA3組。肝單個(gè)核細(xì)胞及肝組織RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)ZHX2組小鼠促炎細(xì)胞因子IL-1β的表達(dá)顯著高于pcDNA3對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義而IFN-γ、TNF-α和iNOS的表達(dá)水平亦具有

16、升高的趨勢(shì)。以上結(jié)果提示，ZHX2過(guò)表達(dá)可加重ConA誘導(dǎo)的肝損傷并促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的分泌。
　　3.ZHX2在巨噬細(xì)胞中表達(dá)及其對(duì)巨噬細(xì)胞活化的調(diào)控作用
　　3.1LPS及ConA刺激上調(diào)腹腔巨噬細(xì)胞中ZHX2的表達(dá)
　　以不同劑量ConA刺激腹腔巨噬細(xì)胞，或以同一劑量ConA刺激不同的時(shí)間點(diǎn)，檢測(cè)巨噬細(xì)胞中ZHX2表達(dá)變化。RT-PCR結(jié)果顯示，ConA可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中ZHX2的表達(dá)，而炎性因子IL-1β、IL-6

17、的表達(dá)沒(méi)有變化。以不同劑量LPS刺激腹腔巨噬細(xì)胞，或同一劑量LPS刺激不同的時(shí)間點(diǎn)，RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中ZHX2表達(dá)變化，結(jié)果顯示ZHX2表達(dá)明顯上調(diào)，同時(shí)伴隨炎性因子IL-1β、IL-6表達(dá)的上調(diào)。
　　3.2 ZHX2小干擾可抑制巨噬細(xì)胞炎性因子的分泌
　　利用ZHX2 siRNA敲低小鼠腹腔來(lái)源巨噬細(xì)胞或骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞中ZHX2的表達(dá)，然后以不同劑量的LPS刺激，RT-PCR檢測(cè)ZHX2及炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。結(jié)果顯

18、示，siRNA封閉ZHX2的表達(dá)后，炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6及iNOS與對(duì)照組相比表達(dá)水平有下調(diào)的趨勢(shì)。以上結(jié)果初步提示，ZHX2可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞活化后炎性細(xì)胞因子的分泌。
　　研究結(jié)論及研究意義：
　　1.ZHX2在炎癥性疾病中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究首次證實(shí)ZHX2過(guò)表達(dá)可加重ConA誘導(dǎo)的肝損傷，為ZHX2功能研究提供新的依據(jù)。
　　2.首次發(fā)現(xiàn)炎性刺激可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞中的ZHX2表達(dá)，且干擾ZHX2可影響巨