驅(qū)動(dòng)蛋白分子kif18A各功能域細(xì)胞定位的研究.pdf

1、研究目的:探討人驅(qū)動(dòng)蛋白分子Kif18A的各功能域在真核細(xì)胞中的定位。
　　 研究方法:
　　 1.構(gòu)建驅(qū)動(dòng)蛋白分子Kif18A野生型及各功能域(馬達(dá)區(qū)、桿狀區(qū)、尾區(qū)和馬達(dá)區(qū)含部分桿狀區(qū))的綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒
　　 (1)蛋白野生型表達(dá)質(zhì)粒的制備
　　 采用BIOZOL總RNA提取試劑從MCF7細(xì)胞中抽提總RNA,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計(jì)野生型Kif18A上下游引物,行PCR擴(kuò)

2、增。1.5％瓊脂糖凝膠電泳,Biospin PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物,限制性核酸內(nèi)切酶SalⅠ和EcoRⅠ酶切,酶切片段與酶切線(xiàn)性化處理的綠色熒光表達(dá)質(zhì)粒pEGFP進(jìn)行連接反應(yīng),轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌復(fù)制菌種Top10,篩選陽(yáng)性菌落至含氨芐青霉素終濃度為50μg／mL的LB(Lurie—Bertani)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜,使用Biospin DNA小提試劑盒提純質(zhì)粒。通過(guò)酶切,瓊脂糖凝膠電泳和測(cè)序鑒定質(zhì)粒。
　　 (

3、2)蛋白各功能域表達(dá)質(zhì)粒的制備設(shè)計(jì)各功能域上下游引物
　　 以構(gòu)建的野生型Kif18A蛋白表達(dá)質(zhì)粒為模板,分別PCR擴(kuò)增各功能域核酸序列,同1.2分別酶切連接構(gòu)建綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)轉(zhuǎn)化,篩選陽(yáng)性克隆培養(yǎng)并質(zhì)粒小提后,酶切電泳和測(cè)序結(jié)果鑒定質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　 2.細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)為檢測(cè)質(zhì)粒在真核細(xì)胞中的表達(dá)
　　 人乳腺癌細(xì)胞MCF7接種于24孔板,每孔3×104個(gè)細(xì)胞,用含10％胎牛血清的RPMI-16

4、40培養(yǎng)基,置于37℃,5％CO2孵箱中培養(yǎng)。次日當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)70％左右時(shí),用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染細(xì)胞,每孔0.5μ L Lipofectamine2000+0.5μ g質(zhì)粒+100μL無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基,對(duì)照組轉(zhuǎn)等劑量pEGFP空載體。轉(zhuǎn)染4～6h換成含10％胎牛血清的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜。
　　 3.表達(dá)產(chǎn)物的免疫印跡質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過(guò)夜
　　 刮取細(xì)胞,用蛋白質(zhì)裂解液冰上裂解40min,4℃

5、最高速離心后取上清,并使用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒進(jìn)行蛋白定量檢測(cè),各取相同蛋白量上樣,7.5％聚丙烯酰胺凝膠電泳穩(wěn)流30mA,1.5h分離蛋白質(zhì),轉(zhuǎn)膜400mA,2h,5％脫脂奶粉封閉1h,以抗GFP抗體孵育2h,辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的IgG為二抗1h,增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑(ECL)反應(yīng)5min,暗室內(nèi)顯影。根據(jù)顯影結(jié)果分析各條帶分子量大小,檢測(cè)各質(zhì)粒的表達(dá)情況。
　　 4.細(xì)胞爬片、轉(zhuǎn)染及免疫熒光染色
　　 MCF7細(xì)胞接種

6、于加飛片的24孔板中,每孔3×104個(gè)細(xì)胞,同上1.4培養(yǎng)并次日做轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染過(guò)夜后置于熒光顯微鏡下觀(guān)察,細(xì)胞表達(dá)綠色熒光比率達(dá)60％～70％。取出細(xì)胞飛片,用冷1:1甲醇／丙酮固定5min,磷酸鹽緩沖液PBS保持5min。于含10％牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)和0.1％Triton的PBS中封閉20min。PBS—Tx洗片3次,每次5min。加入鼠抗微管蛋白抗體孵育2min。PBS—TX洗3次,每次5

7、min.加入德克薩斯紅(Texas Red)標(biāo)記羊抗鼠二抗避光孵育1h。將二抗完全吸出加入4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI),避光染色10min,用PBS—TX洗2次,每次10min。在載玻片上滴加5μ L防淬滅劑,將飛片倒扣于上,指甲油封片。以上步驟均于室溫進(jìn)行。
　　 5.熒光顯微鏡下觀(guān)察各綠色熒光融合蛋白的具體亞細(xì)胞定位研究結(jié)果
　　 有絲分裂間期,Kif18A蛋白分子的馬達(dá)區(qū)綠色熒光沿微管分布,尾區(qū)在細(xì)胞

8、核和微管上均有分布,桿狀區(qū)則散在分布在胞質(zhì)中；有絲分裂末期,Kif18A的馬達(dá)區(qū)仍沿微管分布,而馬達(dá)區(qū)含部分桿狀區(qū)主要集中在中體部位。
　　 結(jié)論及意義:Kif18A蛋白分子的馬達(dá)區(qū)和尾區(qū)與微管共定位；尾區(qū)含核定位序列；馬達(dá)區(qū)和桿狀區(qū)共同作用才能使該蛋白在有絲分裂末期定位于中體。本實(shí)驗(yàn)著重研究了驅(qū)動(dòng)蛋白分子Kif18A各功能域在真核細(xì)胞間期和有絲分裂后期的具體定位情況,討論了各功能域?qū)τ谠摲肿釉诩?xì)胞內(nèi)定位的主要作用方式,為進(jìn)一步