熱預(yù)處理抗低押誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制及過表達誘導(dǎo)型HSP70的作用.pdf

1、神經(jīng)元凋亡是由基因調(diào)控的、按既定信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進行的程序性死亡。一方面，神經(jīng)元凋亡在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育過程中起著關(guān)鍵作用。另一方面，神經(jīng)元凋亡導(dǎo)致的神經(jīng)元丟失是許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病如阿爾茨海默病(Alzheimer’S disease，AD)、帕金森病(Parkinson’S disease，PD)、肌萎縮性側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)和亨廷頓病(Humington’s dis

2、ease)的主要病理特征，也與各種因素引起的腦缺血損傷密切相關(guān)。所以尋找各種阻止神經(jīng)元凋亡的措施并對其機制進行深入探討對于此類疾病的防治具有重要意義。 本研究以低鉀誘導(dǎo)的CGN凋亡模型為研究對象，探討熱預(yù)處理抗神經(jīng)元凋亡作用及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，并以腺病毒為載體過表達誘導(dǎo)型HSP70，觀察其對低鉀誘導(dǎo)的CGN凋亡的作用，為誘導(dǎo)型HSP70在熱預(yù)處理抗神經(jīng)元凋亡中的作用提供直接的證據(jù)。同時對在熱預(yù)處理誘導(dǎo)的神經(jīng)保護作用中，HSP70和各

3、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間的關(guān)系進行了初步探討。 第一章熱預(yù)處理對低鉀誘導(dǎo)的大鼠小腦顆粒神經(jīng)元凋亡的保護作用 本研究以低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡模型為研究對象，探討熱預(yù)處理抗神經(jīng)元凋亡作用，以便進一步探討其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。 方法小腦顆粒神經(jīng)元的分離培養(yǎng)；體外培養(yǎng)8 d的小腦顆粒神經(jīng)元分為3組：正常對照組(25K組)：去掉原培養(yǎng)基，更換成含25 mmol／L KCl的無血清培養(yǎng)基；低鉀組(5K組)：去掉原培養(yǎng)基，更換成含5

4、mmol／L KCl的無血清培養(yǎng)基；熱預(yù)處理(H+5K組)：去掉原培養(yǎng)基，更換成25 mmol／L KCl的無血清培養(yǎng)基，先行90min、43.5℃熱預(yù)處理，37℃恢復(fù)1h，再將培養(yǎng)基換成5mmol/LKCl的無血清培養(yǎng)基。低鉀24h后觀察。二乙酸熒光素(fluorescein diacetate，F(xiàn)DA)染色檢測神經(jīng)元的存活率(Viability)；Hoechst33258染色觀察神經(jīng)元核及染色質(zhì)的形態(tài)變化；瓊脂糖凝膠電泳(agaro

5、se gel electrophoresis)檢測神經(jīng)元DNA的片段。 結(jié)果 與正常對照組比，低鉀組神經(jīng)元存活率降為35.7％±5.0％(p＜0.01)；Hoechst 33258核染色可見較多凋亡的細胞核；瓊脂糖凝膠電泳可見細胞凋亡的典型生化特征-DNA梯狀條帶。與低鉀組比較，熱預(yù)處理組神經(jīng)元存活率增加為93.1％±4.0％(p＜0．01)；Hoechst 33258核染色出現(xiàn)的凋亡的細胞核明顯減少；瓊脂糖凝膠電泳不再出現(xiàn)D

6、NA梯狀條帶。 結(jié)論 90 min的43.5℃的熱預(yù)處理明顯抑制了低鉀誘導(dǎo)的大鼠小腦顆粒神經(jīng)元凋亡。 第二章熱預(yù)處理抗低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元 凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制 上一部分的研究表明：熱預(yù)處理抑制了低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡。本部分我們擬從信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的角度對熱預(yù)處理抗神經(jīng)元凋亡的機制進行研究。PI3K／Akt通路是一條經(jīng)典的促存活通路，介導(dǎo)了多種神經(jīng)元的存活。在小腦顆粒神經(jīng)元中，許多促存活的因子如IGF

7、、BDNF等都是通過激活P13K／Akt通路而發(fā)揮其抗神經(jīng)元凋亡的作用。MAPK家族在神經(jīng)元存活／凋亡中起著重要的調(diào)節(jié)作用，其中JNK／c-Jun或p38／c-Jun通路被認為是介導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的重要通路，有研究證明了c-Jun的磷酸化為低鉀誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡所必需。因此，本部分中我們著重探索了PI3K／Akt通路和c-Jun在熱預(yù)處理抗低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡中的作用。 方法 小腦顆粒神經(jīng)元的分離培養(yǎng)及凋亡檢測同第一部

8、分；熱預(yù)處理的方法同第一部分；蛋白免疫印跡(western blot)法分別檢測磷酸化Akt和磷酸化GSK3β水平及總Akt水平；逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerasechain reaction，RT-PCR)觀察c-jun基因的表達水平；Westem blot法檢測c-Jun蛋白和磷酸化c-Jun的水平，并檢測c-Jun上游激酶JNK、p38的活性的變化。 結(jié)果 熱應(yīng)激能依賴P

9、I3K誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元Akt和GSK3β的磷酸化，使磷酸化Akt和磷酸化GSK3β的水平增高。PI3K的特異性阻斷劑，Ly294002和Wortmannin都可以明顯地抑制熱預(yù)處理對小腦顆粒神經(jīng)元的保護作用：使神經(jīng)元存活率重新降低；Hoechst 33258核染色重新出現(xiàn)較多凋亡的細胞核；瓊脂糖凝膠電泳重新可見細胞凋亡的典型生化特征-DNA梯狀條帶。熱預(yù)處理引起的Akt和GSK3β磷酸化水平的增高在低鉀過程中持續(xù)存在，Ly294002

10、和Wortmannin則明顯抑制了低鉀過程中熱預(yù)處理引起的Akt和GSK3β的磷酸化。c-jun基因在低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡的過程中被上調(diào)，c-Jun蛋白亦被上調(diào)且活性明顯增加，其上游激酶JNK活性保持不變，而上游激酶p38的活性增加，熱預(yù)處理可以明顯抑制低鉀過程中c-jun基因的上調(diào)、c-Jun蛋白水平的增加及c-Jun蛋白活性的增加，也抑制了低鉀過程中p38活性的增加。 結(jié)論 PI3K/Akt通路參與了熱預(yù)處理對低鉀誘

11、導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡的保護作用；熱預(yù)處理也可能通過抑制低鉀過程中c-Jun的激活和表達而對神經(jīng)元產(chǎn)生保護作用，該抑制作用可能通過抑制p38的活性而產(chǎn)生。 第三章 腺病毒介導(dǎo)的誘導(dǎo)型HSP70的過表達對低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡的影響 本課題組的前期研究表明熱預(yù)處理誘導(dǎo)了小腦顆粒神經(jīng)元中熱休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)的產(chǎn)生。但HSP70的表達是否具有抗低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋

12、亡的作用呢?目前還缺乏直接的證據(jù)。本部分我們采用腺病毒為載體于CGN內(nèi)過表達人誘導(dǎo)型HSP70，觀察其對低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡的作用。 方法 人胚胎腎293細胞(human embryonic kidney 293，HEK 293)的復(fù)蘇、培養(yǎng)及傳代；腺病毒在HEK293細胞中感染及擴增；收集擴增后的腺病毒行CsCl密度梯度超速離心；腺病毒的純化及濃度的檢測；小腦顆粒神經(jīng)元(CGN)的分離和培養(yǎng)；原代培養(yǎng)5d的CGN共感染

13、含人誘導(dǎo)型HSP70和綠色熒光蛋白(GFP)的腺病毒(AdTR5/HSP70-GFP)和四環(huán)素調(diào)控的啟動子(AdCMV/tTA)，或共感染含GFP的腺病毒(AdTR5/GFP)和四環(huán)素調(diào)控的啟動子AdCMV/tTA(對照組)。48h后，采用細胞熒光免疫組織化學(xué)法、Western blot法檢測HSP70的表達，或者換成無血清含5 mmol／L KCl的培養(yǎng)基以誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。24 h后，采用相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學(xué)變化，MTT法檢測神經(jīng)

14、元存活率，Hoechst33258核染色和DNA瓊脂糖凝膠電泳分析神經(jīng)元凋亡，以觀察HSP70過表達對低鉀誘導(dǎo)的CGN凋亡的影響。 結(jié)果 共感染了AdCMV／tTA和AdTR5／HSP70-GFP的CGN過表達了HSP70，抑制了低鉀誘導(dǎo)的CGN的凋亡：使神經(jīng)元存活率由45.5％±5.2％提高至82.3％±5.2％(P<0.01)，核固縮減少，DNA的片段化減輕。 結(jié)論腺病毒介導(dǎo)的人誘導(dǎo)型HSP70的過表達抑制了低鉀誘

15、導(dǎo)的CGN凋亡。 第四章熱預(yù)處理神經(jīng)保護過程中HSP70和各信號 轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間關(guān)系的初步探討。由以上研究結(jié)果，可知：在CGN中，熱預(yù)處理既能激活P13K／Akt通路，也能誘導(dǎo)HSP70的表達，并且激活的P13K／Akt通路和HSP70的過表達都可以抑制低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡；那么，在熱預(yù)處理的神經(jīng)保護作用中，它們之間的關(guān)系如何?我們進行了初步探討。利用P13K的特異性阻斷劑Ly294002來研究熱誘導(dǎo)的HSP70的

16、產(chǎn)生是否由P13K／Akt通路的激活介導(dǎo)；利用HSP70的特異性阻滯劑KNK437來研究熱應(yīng)激激活的P13K／Akt通路是否由HSP70介導(dǎo)、熱預(yù)處理對CGN低鉀過程中Akt的激活、c-Jun活性的抑制作用是否由于HSP70的作用。 方法：小腦顆粒神經(jīng)元的分離與培養(yǎng)、神經(jīng)元存活率的檢測、熱預(yù)處理的方法同第一章；采用Western blot法檢測HSP70、磷酸化Akt和磷酸化c-Jun的水平。 結(jié)果：熱應(yīng)激可以時間依賴性

17、地誘導(dǎo)HSP70的產(chǎn)生，但是Ly294002對熱預(yù)處理誘導(dǎo)HSP70的表達水平?jīng)]有明顯影響；KNK437，熱休克蛋白70(HSP70)的特異性抑制劑，在抑制熱誘導(dǎo)產(chǎn)生的HSP70的同時，也抑制了熱誘導(dǎo)的磷酸化Akt的水平；KNK437可以劑量依賴性地抑制熱預(yù)處理的神經(jīng)保護作用；提取小腦顆粒神經(jīng)元低鉀處理后3 h的蛋白行Western blot分析，發(fā)現(xiàn)：KNK437既抑制了熱引起的HSP70的水平，也抑制了熱誘導(dǎo)的磷酸化Akt水平；熱預(yù)