臍帶間充質(zhì)干細胞調(diào)控神經(jīng)元內(nèi)HSP70的表達治療3型脊髓小腦共濟失調(diào).pdf

1、脊髓小腦性共濟失調(diào)3型(Spinocerebellar ataxia3，SCA3)是我國常見的神經(jīng)系統(tǒng)遺傳變性疾病，目前尚無有效的預(yù)防和治療手段。近年來，有相關(guān)研究提示人臍帶間充質(zhì)干細胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUC-MSCs)是一種理想的治療SCA3的種子細胞。為了進一步探討HUC-MSCs在SCA3以及其它多聚谷氨酰胺疾病中的治療作用及其可能相關(guān)機制，我們的研究從整體

2、層面到分子水平，以B6.SCA3-YAC-84Q轉(zhuǎn)基因小鼠為SCA3動物模型。
　　目的：
　　1.HUC-MSCs是否能夠通過抑制神經(jīng)元核內(nèi)包涵體形成，避免神經(jīng)元損傷，從而改善SCA3轉(zhuǎn)基因小鼠的共濟失調(diào)癥狀;
　　2.HUC-MSCs是否通過旁分泌作用對SCA3發(fā)揮神經(jīng)保護功能;
　　3.HUC-MSCs上述神經(jīng)保護作用的相關(guān)分子機制。通過闡明HUC-MSCs對SCA3型治療作用以及可能的分子機制，為臍帶間充

3、質(zhì)干細胞臨床應(yīng)用治療SCA3奠定夯實的理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　通過組織塊分離培養(yǎng)法分離培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細胞，流式細胞技術(shù)鑒定HUC-MSCs的純度。選取5周齡C57/B6小鼠以及B6.SCA3-YAC-84Q轉(zhuǎn)基因小鼠(SCA3小鼠)作為實驗對象。將實驗動物分成以下三組:正常對照組（WT組）、SCA3生理鹽水對照組(Control組)、SCA3 HUC-MSCs治療組。將2*106HUC-MSCs通過尾靜脈注射，每兩周

4、治療一次。Control組同時注射等體積的生理鹽水。通過曠場試驗及腳印試驗評估HUC-MSCs治療前后小鼠共濟失調(diào)的癥狀。酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測治療前后腦內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子水平的變化。免疫組織染色法觀察治療后小腦浦肯野細胞以及腦干神經(jīng)元的病理學(xué)改變情況、HUC-MSCs在腦內(nèi)的定植和分化以及熱休克蛋白70(Heat shock protein70，HSP70)在小

5、腦及腦干的表達情況。進一步予以HSP70阻斷劑槲皮素(Quercetin，50mg/kg)腹腔注射，通過免疫印跡法(westernblotting，WB)檢測HSP70阻斷后突變蛋白ataxin-3以及caspase3凋亡通路的改變，明確HSP70對突變蛋白的調(diào)控機制。予以IGF-1阻斷劑JB1(1ug/10ul)皮下注射，通過WB檢測IGF-1阻斷后HSP70的改變，明確HUC-MSCs治療后神經(jīng)元內(nèi)HSP70改變的相關(guān)腦內(nèi)調(diào)控機制。

6、
　　結(jié)果：
　　HUC-MSCs治療后可以明顯減輕SCA3轉(zhuǎn)基因小鼠小腦及腦干的萎縮，改善其共濟失調(diào)癥狀。HUC-MSCs治療后可以保護小腦浦肯野細胞和腦干神經(jīng)元，抑制突變蛋白ataxin-3的形成和積聚。通過尾靜脈移植后，少量的HUC-MSCs可以通過血腦屏障，穩(wěn)定且較為聚集的分布在小腦以及腩干組織，但免疫熒光雙標提示HUC-MSCs并沒有向神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細胞以及小腦浦肯野細胞分化。治療后腦內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子IGF-1，N

7、GF，VEGF水平明顯上升。HUC-MSCs治療組，小腦和腦干受累神經(jīng)元內(nèi)分子伴侶HSP70的表達增加，當(dāng)予以HSP70阻斷劑quercetin阻斷后發(fā)現(xiàn)突變蛋白ataxin-3的形成和聚集增加;通過IGF-1阻斷劑JB-1進一步發(fā)現(xiàn)當(dāng)IGF-1表達減少后HSP70的水平會相應(yīng)下降。HUC-MSCs治療后可以通過抑制caspase3凋亡通路減少小腦和腦干內(nèi)受累神經(jīng)元的凋亡。
　　結(jié)論：
　　HUC-MSCs移植后可以增加腦內(nèi)