脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)3型可誘導(dǎo)細(xì)胞模型的建立.pdf

1、研究背景： 脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)(Spinocerebellar ataxia SCA)是一組由遺傳因素造成的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，臨床主要表現(xiàn)為小腦性共濟(jì)失調(diào)，伴眼肌麻痹、錐體系/錐體外系癥狀、癡呆、視網(wǎng)膜病變、周圍神經(jīng)病變等癥狀。其病理改變主要累及小腦皮質(zhì)、齒狀核、腦橋核和下橄欖核及脊髓。 隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，目前有基因定位的SCA亞型已經(jīng)有近30種。在這一大組疾病中，SCA1、SCA3、SCA6、SCA7、SCA17和

2、DRPLA是相應(yīng)致病基因存在CAG擴(kuò)增位點(diǎn)，導(dǎo)致三核苷酸重復(fù)(Trinucleotide repeat，TNR)數(shù)目的變化即動態(tài)突變(Dynamic mutation)引起的，因而又屬于三核苷酸重復(fù)性疾病(Trinucleotide repeat disease，TRD)。CAG編碼谷氨酰胺，所以CAG重復(fù)擴(kuò)增導(dǎo)致的這一類疾病又稱為多聚谷氨酰胺疾病(Polyglutamine，polyGln，PolyQ)。至今為止，SCA確切的發(fā)病機(jī)制

3、尚不清，目前的研究提示涉及核內(nèi)包涵體及泛素—蛋白水解酶通路、轉(zhuǎn)錄下調(diào)、軸突運(yùn)輸障礙、鈣離子失衡、線粒體功能障礙等在內(nèi)的多個因素。 SCA各亞型在不同國家、地區(qū)和種族發(fā)病率有極大的差異，但在大多數(shù)國家和地區(qū)(包括我國)，SCA3所占的比例最高，占SCA的40％—48％，它是位于染色體14q32.1上的Ataxin—3基因CAG重復(fù)擴(kuò)增引起的。正常人CAG重復(fù)次數(shù)為14-37次；患者為56-84次?，F(xiàn)階段用于研究SCA3發(fā)病機(jī)制的

4、模型主要有兩種：體內(nèi)模型和體外模型。由于體外模型可以用于分子學(xué)發(fā)病機(jī)制的研究，較體外模型需要的技術(shù)簡單，得到廣泛應(yīng)用。體外模型主要有瞬時轉(zhuǎn)染，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和可誘導(dǎo)細(xì)胞模型，細(xì)胞類型主要有PC12，COS—7，HEK293等。課題組以前曾用PC12建立過瞬時轉(zhuǎn)染SCA3的細(xì)胞模型，經(jīng)實驗者證實這種細(xì)胞可以用于SCA3發(fā)病機(jī)制的研究。但是瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的轉(zhuǎn)染率比較低，難以發(fā)現(xiàn)干預(yù)后的細(xì)微變化；每次轉(zhuǎn)染效率很難完全一致，實驗的可重復(fù)性也比較差，

5、所以本實驗決定建立SCA3的可誘導(dǎo)PC12Tet—On細(xì)胞模型。 研究策略： 1、載體的構(gòu)建 2、PC12Tet—On細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 3、單克隆的篩選及鑒定 4、細(xì)胞模型經(jīng)NGF誘導(dǎo)為神經(jīng)元后的鑒定 方法及結(jié)果： 一、載體的構(gòu)建 1、目的基因的獲取 將帶有正常CAG重復(fù)次數(shù)的pEGFPC1Ataxin—3Q28和異常CAG重復(fù)次數(shù)的pEGFPC1Ataxin—3Q

6、84分別用primer5.0進(jìn)行酶切位點(diǎn)的分析，選取合適的酶切位點(diǎn)，將帶有正常和異常CAG重復(fù)次數(shù)的Ataxin—3基因從pEGFPC1質(zhì)粒切下來，瓊脂糖電泳將Ataxin—3片段與pEGFPC1片段分離，回收得到Ataxin—3片段。 2、將目的基因連接到pTRE2Hyg2-Myc載體中 在pTRE2hyg2-Myc的多克隆位點(diǎn)上選擇合適的限制性內(nèi)切酶將載體雙酶切，將回收的含有正常和異常CAG重復(fù)次數(shù)的Ataxin—3

7、基因分別用T4連接酶連接到pTRE2hyg2-Myc中。 3、載體的鑒定 將構(gòu)建好的pTRE2Hyg2-Myc—Ataxin—3Q28、pTRE2Hyg2-Myc—Ataxin—3Q84與不帶有目的基因的pTRE2Hyg2-Myc經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定，并用作測序鑒定，發(fā)現(xiàn)與文獻(xiàn)報道序列一致。 二、PC12Tet—On細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 1、篩選單克隆藥物濃度的確定 將2×105個細(xì)胞接種到的10cm的培養(yǎng)皿中

8、，培養(yǎng)基中分別加入0、50、100、200、400、800ug/ml的潮霉素B，隔天顯微鏡下觀察，每4天換液一次，按PC12Tet—On細(xì)胞說明書選取培養(yǎng)5天開始出現(xiàn)大批細(xì)胞死亡，第14天細(xì)胞基本死亡的潮霉素B的濃度。本實驗選取濃度為：200ug/ml。 2、PC12Tet—On細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 將PC12Tet—On細(xì)胞接種于10cm的培養(yǎng)皿中，待到細(xì)胞長到80％融合的時候，用lipofectamine2000分別將pTRE

9、2Hyg2-Myc—Ataxin—3Q28及pTRE2Hyg2-Myc—Ataxin—3Q84轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 三、細(xì)胞模型單克隆的篩選及鑒定 1、單克隆的篩選 將轉(zhuǎn)染后的PC12Tet—On細(xì)胞用含有200ug/ml潮霉素B的培養(yǎng)基培養(yǎng)，約2周后可以在顯微鏡下看到轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞團(tuán)，1個月后，肉眼可以看到轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞團(tuán)，每種轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分別選20個克隆，將細(xì)胞重懸種在24孔板。 2、細(xì)胞模型的Western b

10、lot鑒定 將每種細(xì)胞的克隆種在25cm的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)到90％融合時，傳代后，種到60mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，加DOX培養(yǎng)4天，收蛋白，做Western blot，每種細(xì)胞選擇表達(dá)最強(qiáng)的3個克?。篜C12Tet—OnAtaxin—3Q28選1、9、17；PC12Tet—OnAtaxin—3Q84選3、4、16。再將這3個克隆分別種在60mm的培養(yǎng)皿中，不加DOX，培養(yǎng)4天收蛋白，做Western blot，選取基礎(chǔ)表達(dá)最低的克隆：P

11、C12Tet—OnAtaxin—3Q28選1；PC12Tet—OnAtaxin—3Q84背景表達(dá)都比較高，在誘導(dǎo)表達(dá)次高的4個克隆1、9、12、14中選取背景表達(dá)最低的克隆1。 3、細(xì)胞模型的免疫熒光鑒定 將Western blot選取的細(xì)胞模型種皿，分別作加藥誘導(dǎo)，誘導(dǎo)培養(yǎng)后免疫熒光鑒定，發(fā)現(xiàn)Ataxin—3有表達(dá)。 四、NGF誘導(dǎo)為神經(jīng)元后Ataxin—3基因的表達(dá) 將PC12Tet—OnAtaxin

12、—3Q28和PC12Tet—OnAtaxin—3Q84種在60mm培養(yǎng)皿中，NGF誘導(dǎo)為神經(jīng)元細(xì)胞做Western blot發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染的Ataxin—3仍有表達(dá)。 結(jié)論： 本實驗建立了脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)3型的可誘導(dǎo)細(xì)胞模型，可以根據(jù)需要調(diào)控基因表達(dá)，便于研究早期發(fā)病機(jī)制。此外，脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)3型中雖然致病蛋白Ataxin—3可以在各種非神經(jīng)組織中表達(dá)，但主要表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)的毒性。PC12可以被NGF誘導(dǎo)為神經(jīng)元細(xì)胞，所