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1、目的: 建立動(dòng)物模型,采用免疫組化、RT-PCR、Western免疫印跡分析方法,檢測(cè)雷帕霉素靶蛋白(mTOR)下游底物核糖體蛋白S6激酶(p70 S6K)在正畸牙移動(dòng)牙周組織改建過(guò)程中的表達(dá)及變化,研究正畸力作用下兔牙周組織中核糖體蛋白S6激酶(p70 S6K)在牙周組織改建過(guò)程中的作用。 方法: 1、建立動(dòng)物模型選用36只日本大耳白兔(體重2.0±0.2kg),建立正畸牙移動(dòng)的動(dòng)物模型,按照3天、5天、7天、
2、14天隨機(jī)分組,每組9只。上頜右側(cè)戴矯治器為實(shí)驗(yàn)組,分別在切牙與磨牙的近頸端纏繞雙股結(jié)扎絲,然后在切牙與磨牙間放置鎳鈦螺簧,力值80g,使磨牙近中移動(dòng)。上頜左側(cè)未戴矯治器為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別于3、5、7、14天處死。 2、免疫組化SP法將實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組牙周組織石蠟標(biāo)本進(jìn)行核糖體蛋白S6激酶(p70 S6 Kinase,p70 S6K)免疫組化染色,觀察其表達(dá)并分析其意義。 3、RT-PCR按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說(shuō)明操作,選
3、用oligo dT作引物合成第一鏈cDNA,RT-PCR檢測(cè)正畸力作用下p70 S6K在牙周組織中的表達(dá)變化,瓊脂糖凝膠電泳溴化乙錠染色分析檢測(cè)結(jié)果。 4、Western免疫印跡分析吸取上清,棄沉淀,考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定樣品中蛋白濃度。上清用10% SDS-PAGE分離然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,經(jīng)2h 50V的轉(zhuǎn)印后TTBS洗膜5 min×3次。用含5%BSA的TTBS封閉,4℃過(guò)夜,再與抗p70 S6K抗體室溫孵育2h,與相
4、應(yīng)的HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1:5000)室溫孵育1h,ECL系統(tǒng)顯影。 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)戴矯治器組與未戴矯治器組進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)。P<0.05為顯著性差異。 結(jié)果: 1、組織形態(tài)學(xué)觀察組織形態(tài)學(xué)觀察:實(shí)驗(yàn)組的牙周組織較對(duì)照組有明顯改建,牙槽骨由致密變得疏松,細(xì)胞的排列由有序變紊亂,牙槽骨的骨壁由平整變得凸凹不平,出現(xiàn)了破骨細(xì)胞及骨陷窩。 2、p70 S6K在牙周組織中的定位免疫組化結(jié)
5、果:正畸力作用下p70 S6K在牙周組織細(xì)胞中染色增強(qiáng),且主要定位于成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞胞漿中,血管內(nèi)皮細(xì)胞及骨細(xì)胞胞漿中亦可見(jiàn)。 3、RT-PCR與對(duì)照組比較,加力3天后牙周組織中p70 S6K mRNA表達(dá)增加,7天明顯增加,隨后下降,3天、7天、14天各時(shí)段與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,其中7天差異更顯著。 4、Western免疫印跡分析與RT-PCR結(jié)果相一致。正畸力作用下p70 S6K在兔牙周組織中的蛋白表達(dá)增加
6、,7天尤為顯著,隨后下降。3天、7天、14天各時(shí)段與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,其中7天差異更顯著。 結(jié)論: 1、p70 S6K在正畸力作用下兔牙周組織細(xì)胞中染色增強(qiáng),且主要定位于成骨細(xì)胞,成纖維細(xì)胞胞漿中,血管內(nèi)皮細(xì)胞和骨細(xì)胞胞漿中亦可見(jiàn)。 2、正畸力作用下兔牙周組織中p70 S6K的表達(dá)增加。 3、隨著牙周組織的改建,p70 S6K的表達(dá)量7天時(shí)達(dá)高峰。 4、p70 S6K參與正畸牙移動(dòng)過(guò)程中牙
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