生脈成骨膠囊促進血管生成的機理研究與臨床觀察.pdf

1、目的：研究中藥生脈成骨膠囊藥物血清促進血管生成的作用機理，以及對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株分泌內(nèi)皮素1、前列環(huán)素I2和一氧化氮等血管活性物質(zhì)的影響。為生脈成骨膠囊臨床用于治療股骨頭缺血性壞死，改善股骨頭血液供應(yīng)提供實驗依據(jù)；并通過臨床觀察驗證生脈成骨膠囊促進壞死股骨頭及其周圍血管生成的效果。從現(xiàn)代藥理學(xué)角度闡明“瘀去則新生脈長”的中醫(yī)基礎(chǔ)理論。 方法：在復(fù)習(xí)治療性血管生成的研究進展和臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)之上，結(jié)合該項國家自然科學(xué)基金(No.3

2、0171143)和廣東省自然科學(xué)基金(No.010251)資助項目已經(jīng)取得的階段性成果，本博士課題分為基礎(chǔ)實驗和臨床觀察兩部分進行研究。 基礎(chǔ)實驗：應(yīng)用噻唑藍(lán)(methylthiazolyltetrazolium，MTT)比色法研究生脈成骨膠囊藥物血清對體外培養(yǎng)的人臍靜脈細(xì)胞株(ECV304)增殖的影響，利用酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)檢測生脈成骨膠囊藥物血清作

3、用1h和2h后ECV304細(xì)胞培養(yǎng)上清中血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)濃度，采用ELISA法檢測生脈成骨膠囊藥物血清作用1h和2h后，ECV304細(xì)胞培養(yǎng)上清中內(nèi)皮素1(endothelin-1，ET-1)和前列環(huán)素I2(prostacyclinI2，PGI2)濃度，用硝酸還原酶法檢測生脈成骨膠囊藥物血清作用1h和2h后，ECV304細(xì)胞培養(yǎng)上清中一氧化氮(nitricoxi

4、de，NO)濃度，應(yīng)用透射電鏡技術(shù)觀察生脈成骨膠囊藥物血清作用12h后各組ECV304細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。所得數(shù)據(jù)以SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計分析。 臨床觀察：將納入研究的股骨頭缺血性壞死患者分為單純介入治療組(對照組)和中藥加介入治療組(中藥組)，通過數(shù)字減影血管成像技術(shù)(digitalsubstractionangiography，DSA)觀察治療前及治療2個月后的壞死股骨頭及其周圍血管成像，利用JVCky-F30B3-CCD

5、彩色圖像攝錄輸入儀進行圖像采集及KontroniBAS2.0全自動圖像分析系統(tǒng)計算出治療前后的股骨頭及其周圍血管成像區(qū)域灰度值，并取其差值，以t檢驗進行統(tǒng)計分析。 結(jié)果基礎(chǔ)實驗研究顯示，生脈成骨膠囊藥物血清作用1h后，低劑量組ECV304細(xì)胞培養(yǎng)上清中的VEGF濃度顯著升高(P＜0.01)，生脈成骨膠囊藥物血清作用2h后，低劑量組和中劑量組ECV304細(xì)胞上清中的VEGF濃度均明顯升高(P＜0.01)，但是MTT比色法研究顯示，

6、各劑量組生脈成骨膠囊藥物血清作用12h和36h后對ECV304細(xì)胞增殖均無促進作用(P＜0.05)，中劑量和高劑量藥物血清在36h尚表現(xiàn)出抑制ECV304細(xì)胞增殖的作用(P＜0.01)。生脈成骨膠囊藥物血清作用1h后，高劑量組上清中ET-1濃度顯著降低(P＜0.05)，低、中、高劑量組上清中PGI2濃度均顯著降低(P＜0.05)，而NO濃度均升高，高劑量組(P＜0.05)。作用2h后，高劑量組上清中ET-1濃度升高，低、中、高劑量組上清

7、中PGI2濃度與對照組相比，仍顯著降低(P＜0.05)，但低劑量組上清中PGI2濃度與中劑量組和高劑量組相比，有顯著升高(P＜0.05)，各劑量組NO濃度仍較高，高劑量組(P＜0.05)。提示各劑量組生脈成骨膠囊藥物血清顯著抑制ECV304細(xì)胞分泌PGI2，促進其分泌NO，而對ECV304細(xì)胞分泌ET-1的影響表現(xiàn)為：低劑量組和中劑量組表現(xiàn)升高趨勢，高劑量組藥物血清表現(xiàn)為先抑制后促進ET-1的分泌(P＜0.05)。透射電鏡觀察可見：與陰

8、性對照組、中劑量組和高劑量組相比，低劑量組ECV304細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)目增加，川芎嗪組ECV304細(xì)胞線粒體體積增大，基質(zhì)密度明顯降低，呈腫脹狀態(tài)，內(nèi)膜嵴松散。各劑量組和陰性對照組ECV304細(xì)胞內(nèi)線粒體體積無明顯增大，但高劑量組和中劑量組ECV304細(xì)胞內(nèi)可見數(shù)量較多、體積較大的透明空泡。 臨床研究結(jié)果顯示：在口服生脈成骨膠囊配合常規(guī)介入治療2個月后，與單純介入治療組相比，股骨頭缺血性壞死患者的壞死股骨頭及其周圍血管成像區(qū)域灰度

9、值顯著增加(P＜0.05)，臨床癥狀改善明顯，患側(cè)髖關(guān)節(jié)Harris評分增加。 結(jié)論基礎(chǔ)實驗研究提示，低劑量生脈成骨膠囊藥物血清可促進ECV304細(xì)胞分泌VEGF，這可能是其促進血管生成的重要作用機制，這種作用無明顯的量效關(guān)系，而呈雙相性；高、中、低劑量組生脈成骨膠囊藥物血清均顯著抑制ECV304細(xì)胞分泌PGI2，從而解釋了該藥具有明顯抗炎鎮(zhèn)痛作用的機理；各劑量組生脈成骨膠囊藥物血清均促進ECV304細(xì)胞分泌NO，但對ECV30

10、4細(xì)胞分泌的ET-1影響則表現(xiàn)為高劑量組生脈成骨膠囊藥物血清先抑制后促進的雙向作用；各劑量組生脈成骨膠囊藥物血清對體外培養(yǎng)的ECV304細(xì)胞增殖未見明顯的促進作用，對其超微結(jié)構(gòu)未見明顯影響，而川芎嗪可能對ECV304細(xì)胞的線粒體結(jié)構(gòu)造成損害。 臨床研究顯示，生脈成骨膠囊口服結(jié)合介入技術(shù)治療股骨頭缺血性壞死可以顯著增加壞死股骨頭及其周圍的血管成像區(qū)域灰度值，并有效改善患髖的臨床癥狀及功能，從治療性血管生成角度證實生脈成骨膠囊是治療