ApoE---小鼠血管膽固醇攝取和外排基因表達動態(tài)變化以及丹參酮ⅡA抗AS作用機制探討.pdf

1、第一部分 第一章ApoE<'-/->小鼠血管膽固醇攝取和外排基因表達的動態(tài)變化 研究目的：血管脂質(zhì)沉積是動脈粥樣硬化(AS)早期病變的主要特征之一，而血管膽固醇攝取和外排失衡是脂質(zhì)沉積的重要原因，其分子機制可能與攝取和外排相關(guān)基因表達水平發(fā)生變化有關(guān)。本研究旨在動念觀察ApoE基因敲除小鼠(ApoE<'-/->)AS形成和發(fā)展過程中血管膽固醇攝取和外排相關(guān)基因表達的變化。 方法：采用6-40周齡雄性ApoE<'-

2、/->小鼠，分別用油紅O染色主動脈幫H&E染色心臟主動脈瓣并量化分析AS斑塊形成情況；Elisa法測定血清oxLDL含量；RT-PCR法測定血管膽固醇攝取受體CD36和SR-A以及外排相關(guān)受體PPAR7，LXRoα和ABCA1基因表達。 結(jié)果：隨著周齡的增加，ApoE<'-/->小鼠As病變越來越嚴重，表現(xiàn)在主動脈弓斑塊面積逐步增加，心臟主動脈瓣內(nèi)膜逐步增厚；預(yù)防性給予維生素E(24周前)能夠明顯抑制ApoE<'-/->小鼠AS

3、早期病變，而治療性給予維生素E(24周后)對AS晚期病變沒有顯著影響。另外，隨著周齡的增加,ApoE<-/->小鼠血清oxLDL含量先明顯增加(6-24周)而后保持基本不變(24周后)；預(yù)防性給予維生素E能夠顯著降低血清oxLDL含量，而治療性給予維生素E則對血清oxLDL含量沒有明顯影響。還有，隨著周齡的增加，ApoE<'-/->小鼠血管膽固醇攝取相關(guān)基因，即清道夫受體CD36和SR-A表達先明顯上調(diào)(6-24N)而后保持基本不變(2

4、4周后)；而血管膽固醇外排相關(guān)基因，即PPARγ，LXRα，ABCA1表達呈現(xiàn)出先明顯上調(diào)(6-24N)而后顯著下調(diào)(24N后)的結(jié)果。與相應(yīng)周齡的ApoE<'-/->小鼠相比，24N前給予維生素E能夠明顯下調(diào)上述所有基因的表達，而24周后則對所有基因表達沒有顯著影響。 結(jié)論：ApoE<'-/->小鼠AS形成和發(fā)展過程中，在基因水平上，攝取相對增加是早期AS病變形成的主要原因，而外排障礙則是晚期AS病變發(fā)展的主要因素。另外，預(yù)防

5、性給予維生素E能夠抑制ApoE<'-/->小鼠AS形成，而治療性給藥則不能抑制AS的進一步發(fā)展。 第二章預(yù)防性給予丹參酮Ⅱ A抗ApoE<'-/->小鼠AS作用及其機制探討 目的：前期研究發(fā)現(xiàn)，清道夫受體CD36和SR-A在ApoE<'-/->小鼠早期動脈粥樣硬化(AS)形成中具有非常重要的作用；研究還發(fā)現(xiàn)，丹參酮Ⅱ A能夠明顯抑制大鼠和家兔AS形成。本研究旨在觀察預(yù)防性給予丹參酮Ⅱ A對ApoE<'-/->小鼠AS形成的

6、影響并在分子水平上探討其可能的作用機制。 方法：將6周齡雄性ApoE<'-/->小鼠隨機分為模型對照組、丹參酮Ⅱ A(10-90kg/kg)組、辛伐他汀組和維生素E組；另將6周齡雄性C57BL/6J小鼠作為正常對照組。分別用油紅EO染色主動脈弓和H&E染色心臟主動脈瓣并量化分析AS斑塊形成情況；Elisa法測定血清oxLDL含量；RT-PCR法測定血管CD36和SR-A基因表達情況。 結(jié)果：C57BL/6J小鼠在整個試驗

7、過程中沒有形成明顯的AS病變，而24周齡ApoE<'-/->小鼠在主動脈弓和心臟主動脈瓣均形成明顯的AS斑塊。與模型對照組相比，丹參酮Ⅱ A(10-90mg/kg)能夠劑量依賴性地抑制ApoE<'-/->小鼠AS病變，包括減少主動脈弓斑塊面積和心臟主動脈瓣內(nèi)膜厚度，還能夠降低主動脈膽固醇含量。降脂藥辛伐他汀和抗氧化劑維生素E也能夠抑制ApoE<'-/->小鼠AS病變。血脂和肝臟脂質(zhì)測定發(fā)現(xiàn)，模型ApoE<'-/->小鼠脂質(zhì)含量比正常C5

8、7BL/6J小鼠顯著增加；丹參酮ⅡA和維生素E對血清和肝臟TC和TG含量沒有明顯影響；而辛伐他汀能夠輕微降低血清TC和TG含量，對肝臟脂質(zhì)水平?jīng)]有顯著影響。Elisa法測定血清oxLDL含量發(fā)現(xiàn)，丹參酮Ⅱ A、辛伐他汀和維生素E都能夠顯著降低oxLDL水平。與正常C57BL/6J小鼠相比，模型ApoE<'-/->小鼠血管清道夫受體CD36和SR-A基因表達水平顯著上調(diào)，而丹參酮Ⅱ A能夠呈劑量依賴性地下調(diào)其表達；辛伐他汀和維生素E也具有

9、相似的作用。 結(jié)論：預(yù)防性給予丹參酮ⅡA能夠明顯抑制ApoE<'-/->小鼠AS病變，該作用可能與其抑制LDL氧化，下調(diào)血管CD36和SR-A基因表達從而減少泡沫細胞形成有關(guān)。 第三章治療性給予丹參酮Ⅱ A抗ApoE<'-/->小鼠AS作用及其機制探討 目的：前期研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)防性給予丹參酮ⅡAS對ApoE<'-/->小鼠早期動脈粥樣硬化(AS)形成有明顯的抑制作用。本研究旨在觀察治療性給予丹參酮Ⅱ A對ApoE<

10、'-/->小鼠AS進一步發(fā)展的影響并在分子水平上探討其可能的作用機制。 方法：將22周齡雄性ApoE<'-/->小鼠隨機分為模型對照組、丹參酮Ⅱ A(10-90kg/kg)組，分別用油紅O染色主動脈弓和H&E染色心臟主動脈瓣并量化分析AS斑塊形成情況；Elisa法測定血清oxLDL含量；RT-PCR法測定血管CD36，SR-A，PPAR7，LXRa和ABCA1基因表達情況。 結(jié)果：與模型對照組相比，丹參酮Ⅱ A(10-9

11、0mg/kg)能夠劑量依賴性地抑制ApoE<'-/->4、鼠AS病變進一步發(fā)展，表現(xiàn)為減少主動脈弓斑塊面積和心臟主動脈瓣內(nèi)膜厚度，還能夠降低主動脈膽固醇含量。然而，丹參酬ⅡA對血脂和肝臟脂質(zhì)水平?jīng)]有明顯影響。盡管丹參酮ⅡA(90mg/kg)能顯著降低血清oxLDL和MDA含量，提高血清SOD活性，但并不能很好地解釋丹參酮Ⅱ A(10-90mg/kg)的抗AS作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮Ⅱ A對ApoE<'-/->小鼠血管清道夫受體CD3

12、6和SR-A基因表達水平?jīng)]有顯著影響，但能夠明顯上調(diào)其膽固醇外排基因PPARγ，LXRα和HABCA1的表達水平。 結(jié)論：治療性給予丹參酮ⅡA能夠明顯抑制ApoE>'-/->小鼠AS病變的進一步發(fā)展，該作用可能與其上調(diào)膽固醇外排基因表達水平從而促進血管膽固醇外排有關(guān)。 第二部分 第一章高膽固醇血癥對大劑量維生素D誘發(fā)的大鼠血管鈣化的影響及其機制探討 目的：研究發(fā)現(xiàn)，高膽固醇血癥在動脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生

13、和發(fā)展中具有非常重要的作用，并與心血管疾病事件的發(fā)生呈高度正相關(guān)。血管鈣化是AS病變的一個基本特征，是心血管功能發(fā)生紊亂的重要因素。本研究旨在觀察高膽固醇血癥對大劑量維生素D誘導(dǎo)的大鼠血管鈣化的影響并探討其可能的作用機制。 方法：用大劑量維生素D單獨或合并高膽固醇飼料建立大鼠血管鈣化模型；體外培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細胞，含有β-甘油磷酸的培養(yǎng)基單獨或合并氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)建立細胞鈣化模型。Von Kossa染色法，生化

14、法和原子吸收法測定血管和細胞鈣含量。Elisa法測定血清oxIDL含量。酶法和RT-PCR法分別測定血管和細胞堿性磷酸酶(ALP)活性和基因表達水平。 結(jié)果：與單獨給予維生索D相比，同時給予高膽固醇飼料的大鼠形成了明顯的高膽固醇血癥，血管鈣含量顯著增加，血管ALP活性和基因表達水平明顯增加；同時，大鼠血清0xLDL和MDA含量明顯增加，血清SOD活性顯著下降，而血管超氧陰離子含量明顯增加。降脂藥辛伐他汀和抗氧化劑維生素E均能夠顯

15、著逆轉(zhuǎn)上述作用。在細胞水平上，oxLDL能夠劑量依賴性地促進血管平滑肌細胞鈣沉積，提高細胞ALP活性和基因表達水平。 結(jié)論：高膽固醇血癥能夠促進大劑量維生素D誘發(fā)的大鼠血管鈣化，該作用可能與其介導(dǎo)的氧化應(yīng)激，特別是增加oxLDL生成有關(guān)。該研究為他汀類藥物和抗氧化劑抗AS作用提供了新的實驗依據(jù)。 第二章丹參酮Ⅱ A對大鼠AS形成的影響及其作用機制探討 目的：觀察丹參酮Ⅱ A對大鼠動脈粥樣硬化(AS)形成的影響并探

16、討其可能的作用機制。 方法：用大劑量維生素D合并高膽固醇飼料建立大鼠AS模型，Elisa法測定血清oxLDL和血管中血管細胞粘附分子-1(VCAM一-1)，細胞間粘附分子-1(ICAM-1)，單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)含量。激光共聚焦法測定血管超氧陰離子水平。免疫組化和Westem blot法測定血管Cu/Zn SOD和內(nèi)皮源性NO合酶(eNOS)蛋白表達。 結(jié)果：與模型組大鼠相比，丹參酮ⅡA(35，70mg/k

17、g)能夠劑量依賴性地抑制大鼠AS病變形成，包括減少血管內(nèi)膜厚度和中膜平滑肌細胞增生，降低血管脂質(zhì)和鈣沉積。研究還發(fā)現(xiàn)，丹參酮Ⅱ A對血脂水平?jīng)]有明顯影響，但能夠降低血清oxLDL和MDA含量；還能夠減少血管VCAM-1，ICAM-1，MCP-1含量，提高血管Cu/Zn SOD、eNOS活性和蛋白表達水平，從而相應(yīng)地抑制血管超氧陰離子生成和提高血管NO含量。 結(jié)論：丹參酮Ⅱ A能夠顯著抑制大鼠AS形成，該作用可能與其抑制JLDL氧