miR-320a靶向調(diào)節(jié)MMP9抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞功能及機(jī)制研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　第一部分、TAD差異miRNAs在人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)驗(yàn)證
　　目的:檢測(cè)芯片差異miRNAs在HAVSMC中的表達(dá)含量。
　　方法:
　　①從已知胸主動(dòng)脈夾層與正常主動(dòng)脈中膜芯片分析結(jié)果中挑選出差異表達(dá)的38個(gè)miRNAs。
　?、谠O(shè)計(jì)38對(duì)miRNA引物。
　?、廴酥鲃?dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞傳代培養(yǎng);
　?、芴崛】俁NA，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，分析結(jié)果。
　

2、　結(jié)果:38個(gè)miRNAs在HAVSMC中均有表達(dá)，其中12個(gè)呈高表達(dá)，8個(gè)呈中度表達(dá)，18個(gè)呈低表達(dá)。
　　結(jié)論:HAVSMC不同miRNA的表達(dá)水平存在差異。
　　第二部分功能性miRNAs高內(nèi)涵篩選
　　目的:篩選出對(duì)HAVSMC具有明確功能的miRNAs。
　　方法:
　　①慢病毒/腺病毒轉(zhuǎn)染HAVSMC預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定病毒載體。
　?、趶纳鲜霰磉_(dá)驗(yàn)證的38個(gè)miRNAs中挑選出20個(gè)miRNA。

3、
　?、勖鞔_miRNA模擬表達(dá)趨勢(shì)（上調(diào)/下調(diào)），構(gòu)建相應(yīng)的腺病毒載體，轉(zhuǎn)染HAVSMC。
　?、芑贑ellomics高通量篩選系統(tǒng)，實(shí)時(shí)細(xì)胞計(jì)數(shù)，檢測(cè)細(xì)胞增殖。
　　結(jié)果:
　?、傧俨《緦?duì)HAVSMC更敏感;
　　②各實(shí)驗(yàn)組，連續(xù)5天，記錄細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，組間細(xì)胞增殖存在差異。
　　結(jié)論:篩選出的14/20個(gè)miRNA對(duì)HAVSMC增殖功能有影響;HCS應(yīng)用于miRNA的批量篩選，準(zhǔn)確、

4、穩(wěn)定、可信度高。
　　第三部分、miR-320a靶向調(diào)節(jié)MMP9抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞增殖遷移功能
　　目的:探討miR-320a對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(HAVSMC)增殖遷移功能的影響及潛在的機(jī)制。
　　方法:建立HAVSMC培養(yǎng)體系，
　?、賀T-PCR檢測(cè)miR-320a mimics轉(zhuǎn)染人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的效率;
　　②CCK-8細(xì)胞增殖法，檢測(cè)血管緊張

5、素Ⅱ?qū)θ酥鲃?dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞作用的時(shí)間、濃度曲線以及miR-320a對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的HAVSMC增殖作用的影響;
　?、奂?xì)胞劃痕、transwell驗(yàn)證miR-320a對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的HAVSMC遷移功能的影響;
　?、躌T-PCR檢測(cè)miR-320a作用于HAVSMC后的MMP9的mRNA表達(dá)水平變化;
　　⑤Western Blot檢測(cè)人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞MMP-9蛋白水平變化以及MAPK/ERK通路蛋白的表達(dá)變