甲潑尼龍琥珀酸鈉對(duì)腎上腺素致大鼠神經(jīng)源性肺水腫肺組織中的AQP5表達(dá)的影響.pdf

1、神經(jīng)源性肺水腫(Neurogenic Pulmonary Edema，NPE)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一。是指無(wú)原發(fā)性心、肺、腎等疾病，由中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾?。ㄈ顼B腦損傷等）引起的突發(fā)性的顱內(nèi)壓增高而導(dǎo)致的肺水腫，也稱中樞性肺水腫。近年來(lái)，常由發(fā)病率顯著升高的重癥手足口病(EV71感染)導(dǎo)致，使過(guò)多的液體蓄于肺間質(zhì)或肺泡內(nèi)，形成間質(zhì)性或肺泡性肺水腫。重癥手足口病所致神經(jīng)源性肺水腫的臨床表現(xiàn)為呼吸困難、呼吸窘迫、咳粉紅色泡沫

2、痰、咯血、呼吸循環(huán)衰竭等急性癥狀，其發(fā)病急，病情較兇險(xiǎn)，進(jìn)展迅猛，治療困難、死亡率高(90％)。在醫(yī)學(xué)界，對(duì)NPE發(fā)病機(jī)制的研究一直是比較活躍的一個(gè)領(lǐng)域，盡管有許多學(xué)者對(duì)此已經(jīng)做了大量的研究工作，但神經(jīng)源性肺水腫的確切機(jī)理至今仍不十分清楚。在其病理改變中，肺部通透性增加是一個(gè)特征性的表現(xiàn)。
　　 AQP5廣泛分布于肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞的腔頂面，還位于鼻咽和呼吸道黏膜下腺上皮細(xì)胞腔頂面及氣道上皮細(xì)胞腔膜面，AQP5在肺組織中表達(dá)最多。

3、是肺組織水轉(zhuǎn)運(yùn)功能中液體快速轉(zhuǎn)運(yùn)的通道，對(duì)維持肺組織的正常生理功能、肺水轉(zhuǎn)運(yùn)中起到不可低估的作用。甲潑尼龍琥珀酸鈉是人工合成的糖皮質(zhì)激素，在治療手足口病中，是一種常用的物，藥作用時(shí)間屬中效類，具有強(qiáng)大的抗炎作用，可以改善神經(jīng)傳導(dǎo)功能，減輕炎癥和水腫，減少兒茶酚胺的縮血管功能和血栓的形成，能降低毛細(xì)血管通透性，減輕肺水腫，同時(shí)有效防治腦水腫，阻斷肺水腫-腦水腫的惡性循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察不同劑量的甲強(qiáng)龍（甲潑尼龍琥珀酸鈉）對(duì)腎上腺素誘導(dǎo)的神

4、經(jīng)源性肺水腫大鼠肺組織AQP5的表達(dá)、病理形態(tài)學(xué)、濕干重比值等的影響，探討其對(duì)神經(jīng)源性肺水腫的保護(hù)作用，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 目的:
　　 觀察不同劑量的甲潑尼龍琥珀酸鈉對(duì)腎上腺素誘導(dǎo)的神經(jīng)源性肺水腫大鼠肺組織AQP5的表達(dá)、病理形態(tài)學(xué)、濕干重比值等的影響，探討其對(duì)神經(jīng)源性肺水腫是否具有保護(hù)性作用差異。
　　 方法:
　　 1、動(dòng)物模型的制備
　　 Wistar大鼠雌雄不拘，1月齡，體

5、重100±8g，腹腔注射腎上腺素造模型，神經(jīng)源性肺水腫組大鼠按2.7mg/kg給予腹腔注射腎上腺素注射液(1mg∶1ml)，觀察20min左右，大多數(shù)大鼠腹腔注射后約5 min左右出現(xiàn)呼吸頻率加快、弓背，15 min可見(jiàn)呼吸困難，若存活時(shí)間大于20min者，則造模成功。以10％水合氯醛腹腔注射麻醉，將麻醉后的大鼠臥位置于操作臺(tái)上，去毛。取上腹正中切口，打開(kāi)胸腔，結(jié)扎氣管，取出雙肺。
　　 2、動(dòng)物分組
　　 將Wista

6、r大鼠50只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n=10)、神經(jīng)源性肺水腫組(NPE組，n=10)、甲強(qiáng)龍治療組(n=30)，后又以不同劑量分為三個(gè)亞組，每個(gè)亞組10只大鼠。其中甲強(qiáng)龍治療組于造模后立即腹腔注射。
　　 3、肺形態(tài)觀察
　　 麻醉大鼠后，迅速開(kāi)胸，暴露氣管，用線扎住氣管下端把肺完整地取下，觀察肺的顏色和形態(tài)。
　　 4、肺濕干重比檢測(cè)
　　 用吸水紙吸干大鼠右肺中葉表面水分和血液，電子天平稱濕重。將右肺

7、中葉置于65℃烘箱內(nèi)72h至恒重，再稱干重，計(jì)算右肺中葉濕/干重比值(W/D)。
　　 5、病理形態(tài)學(xué)觀察
　　 分別取左肺放入4％甲醛中固定，4℃存放至肺組織沉到瓶底，之后脫水、透明、包埋、石蠟切片，然后進(jìn)行HE染色，觀察肺組織病理學(xué)改變。
　　 6、肺組織AQP5免疫組化染色
　　 采用鏈霉素-親合素-生物素過(guò)氧化物酶法(SABC)。切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化后，用3％過(guò)氧化氫去除內(nèi)源性氧化酶，微波抗原修復(fù)

8、，余步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用已知陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。AQP5抗體稀釋濃度為1∶400。光鏡下出現(xiàn)細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色著染者為陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)視野(200×)測(cè)定其吸光度值(absorbance，A)，計(jì)算平均A值反映其表達(dá)強(qiáng)弱。
　　 7、實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)AQP5mRNA表達(dá)
　　 取右肺上葉組織，采用TRIzol試劑（購(gòu)自invitrogen公司）參照說(shuō)明書(shū)提取各組

9、大鼠的肺細(xì)胞總RNA，再逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以適量cDNA為模板。將配制好的PCR反應(yīng)溶液置于Realtime PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件相同。AQP5引物（由invitrogen公司合成），引物序列:GAPDHβ-actin:上游引物5’-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3’;下游引物5’-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3’;(244bp)，AQP5上游引物5’-GTGACAGACAAGCCAATGGA

10、TAA-3’;下游引物5’-GCCCTCTTAATAGGAAACCAGAT-3’(287bp)。
　　 8、AQP5 Western blot
　　 取右肺下葉組織500mg加上1ml提取液用玻璃勻漿器勻漿后提取，4℃，12000r/min，離心5min，取上清液，然后加入等體積的2xSDS上樣緩沖液，在100℃水中煮沸5 min。進(jìn)行凝膠電泳，每孔上樣等量的總蛋白。將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5％脫脂奶粉封閉2h后，加

11、入1∶250的第一抗體過(guò)夜，再加入1∶6500 HRP標(biāo)記的第二抗體，室溫振搖2h，ECL顯色。使用Gel-pro凝膠分析軟件，測(cè)定其平均光密度值(OD值)，以光密度值代表AQP5蛋白的表達(dá)量。待測(cè)AQP5蛋白表達(dá)量與內(nèi)參照β-actin(GAPDH)表達(dá)量進(jìn)行對(duì)比，表示AQP5蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 1、大鼠一般情況觀察
　　 NPE組大鼠較對(duì)照組呼吸明顯加快、躁動(dòng)，大鼠雙肺底可聞及濕羅音;各

12、不同劑量甲強(qiáng)龍(Methylprednisolone MP)治療組大鼠呼吸無(wú)明顯加快、躁動(dòng)，主要表現(xiàn)為活動(dòng)減少，存活時(shí)間延長(zhǎng)。
　　 2、肺組織形態(tài)學(xué)觀察
　　 對(duì)照組的肺外觀呈白色，較實(shí)，沒(méi)有水腫。NPE組雙肺體積明顯增大、水腫、淤血、表面分布大片狀暗紅色出血灶，氣管內(nèi)可見(jiàn)泡沫樣液體。甲強(qiáng)龍各治療組較NPE組雙肺體積減小，水腫減輕，肺表面散在點(diǎn)狀或小片狀暗紅色出血灶?？梢?jiàn)隨治療量增加，出血、水腫明顯減輕。
　　

13、 3、肺W/D重比值
　　 NPE組W/D(6.6080±0.4319)與對(duì)照組(4.0870±0.5279)相比，明顯升高(P＜0.05)，各甲強(qiáng)龍治療組W/D比NPE組明顯降低(P＜0.05)，三組相比(5.8279±0.8050)、(5.2430±0.3359)、(4.5900±0.5390)，MP30mg/kg治療組W/D最低(P＜0.05)。
　　 4、肺組織病理學(xué)改變
　　 對(duì)照組肺泡腔無(wú)充血、出血，

14、肺泡結(jié)構(gòu)清晰。NPE組在光鏡下肺泡失去正常的結(jié)構(gòu)，肺泡壁增寬，肺泡過(guò)度擴(kuò)張，肺泡腔充滿大量出血及炎性細(xì)胞。各MP治療組與NPE組相比，病理改變明顯減輕。
　　 5、肺組織AQP5免疫組化染色
　　 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果以IOD值表示AQP5蛋白表達(dá)的相對(duì)強(qiáng)度，正常對(duì)照組肺組織中AQP5在肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞的腔頂面有廣泛而強(qiáng)烈的表達(dá)。NPE組（0.0784±0.0095）與對(duì)照組（0.5572±0.0834）相比，AQP5蛋

15、白表達(dá)較對(duì)照組減少，染色變淺，AQP5表達(dá)明顯減弱(P＜0.05);甲強(qiáng)龍各治療組A組、B組、C組(0.2385±0.0676)(0.3441±0.0673)(0.4432±0.0653)較NPE組（0.0784±0.0095）AQP5表達(dá)顯著加強(qiáng)(P＜0.05);A組、B組、C組(0.2385±0.0676)、(0.3441±0.0673)、(0.4432±0.0653)三組相比，C組(0.4432±0.0653)AQP5密度最高，有

16、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 6、AQP5mRNA表達(dá)水平
　　 在287bp處可見(jiàn)AQP5mRNA表達(dá)，NPE組與對(duì)照組相比，AQP5表達(dá)明顯減弱(P＜0.05);甲強(qiáng)龍各治療組較NPE組AQP5表達(dá)顯著加強(qiáng)(P＜0.05);A組、B組、C組三組相比，C組AQP5 mRNA表達(dá)水平最高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 7、AQP5蛋白表達(dá)水平
　　 NPE組（0.2165±0.0202）肺組

17、織 AQP5表達(dá)與對(duì)照組（0.6470±0.1518）相比，AQP5表達(dá)明顯減少(P＜0.05);甲強(qiáng)龍各治療組A組、B組、C組（0.3641±0.0202）（0.3788±0.1347）（0.5243±0.0937）肺組織AQP5表達(dá)較NPE組（0.2165±0.0202）AQP5表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.05）;A組、B組、C組（0.3641±0.0202））（0.3788±0.1347）（0.5243±0.0937）三組相比，C組（0

18、.5243±0.0937）表達(dá)明顯增強(qiáng)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、給予腹腔注射腎上腺素注射液(1mg∶1ml)，肉眼可見(jiàn)NPE組雙肺體積明顯增大、水腫、淤血、表面分布大片狀暗紅色出血灶，氣管內(nèi)可見(jiàn)泡沫樣液體。HE染色發(fā)現(xiàn)對(duì)照組肺泡腔無(wú)充血、出血，肺泡結(jié)構(gòu)清晰。NPE組在光鏡下肺泡失去正常的結(jié)構(gòu)，肺泡壁增寬，肺泡過(guò)度擴(kuò)張，肺泡腔充滿大量出血及炎性細(xì)胞。且肺濕/干重比明顯增加，綜上說(shuō)明大鼠NPE

19、模型制備成功。
　　 2、腎上腺素誘導(dǎo)的神經(jīng)源性肺水腫大鼠肺組織AQP5表達(dá)較正常對(duì)照組顯著降低，提示AQP5在肺臟的水液平衡中起作用，在神經(jīng)源性肺水腫時(shí)是一種保護(hù)蛋白。因而我們推測(cè)AQP5的表達(dá)減少導(dǎo)致肺泡水清除率能力下降，推測(cè)可能導(dǎo)致神經(jīng)源性肺水腫的形成。
　　 3、在應(yīng)用甲潑尼龍琥珀酸鈉治療后可使神經(jīng)源性肺水腫大鼠肺濕/干比值(W/D)降低，AQP5表達(dá)上升，肺水腫減輕，說(shuō)明甲潑尼龍琥珀酸鈉對(duì)AQP5的表達(dá)有上調(diào)作