多巴酚丁胺增加內(nèi)毒素致肺損傷大鼠的肺泡液體清除率及AQP5和cAMP的表達(dá).pdf

1、目的：
　　 急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)，是嚴(yán)重的急性肺損傷(ALI)，以微血管的通透性增加，嚴(yán)重的低氧血癥，彌漫性的肺侵潤為特點(diǎn)，其臨床病死率可以達(dá)到40-50％。本研究探討了多巴酚丁胺對(duì)急性肺損傷大鼠的肺泡液體清除率(AFC)以及水通道蛋白5(AQP5)及環(huán)磷酸腺苷(cAMP)表達(dá)的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)材料：
　　 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　 健康Wistar大鼠64只，雄性，體重(3—4月齡，300-35

2、0g)，中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
　　 2、實(shí)驗(yàn)試劑
　　 戊巴比妥鈉(上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站)；多巴酚丁胺(上海第一生化制藥)；大腸桿菌內(nèi)毒素LPS(Escherichia coli)(Sigma，USA)；EVANS藍(lán)(Sigma，USA)；水通道蛋白5抗體(Anti-aquaporin5)andβ肌動(dòng)蛋白抗體(anti-β-actin)(AlphaDiagnostic International，

3、USA)；Trizol(Invitrogen，USA)；AQP5 andβ-Actin cDNAPrimers(Shanghai Genebase Gen-Tcch Ltd，China)；RT-PCR試劑盒(Promega，美國)；聚偏二氟乙烯(PVDF)蛋白印跡膜(Bio-Rad，美國)；逆轉(zhuǎn)錄酶、PCR所需酶和其他試劑(Takara公司，日本)；PBS等其他試劑為國產(chǎn)
　　 3、主要實(shí)驗(yàn)儀器
　　 (1)小型動(dòng)物呼吸

4、機(jī)(Harvard638型，美國)
　　 (2)超低溫冰箱(SANYO MDF-U，日本)
　　 (3)烘箱(上海躍進(jìn))
　　 (4)水浴箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)
　　 (5)分光光度儀(島津公司，日本)
　　 (6)微量輸液泵(JMS，美國)
　　 (7)水平板電泳系統(tǒng)(BIO—RAD sub-cell GT，美國)
　　 (8)通用電泳儀(BIO-RAD PowerPac200

5、，美國)
　　 (9)臺(tái)式低溫高速冷凍離心機(jī)(Sigma3K30，美國)
　　 (10)壓力換能器(Edwards LifeSciences，美國)
　　 (11)自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀(Alphainnotech Chemilmager，美國)
　　 (12)小型垂直電泳儀(Bio—Rad Mini-Protein III，美國)
　　 (13)半干轉(zhuǎn)印儀(Bio-Rad Seimidry tr

6、ansfer system，美國)
　　 (14)自動(dòng)封膜儀(江蘇儀器設(shè)備公司，中國)
　　 (15)HEIDOLPH DIAX900型勻漿機(jī)(德國)
　　 (16)PTC-100型PCR擴(kuò)增儀(美國)
　　 (17)GLS-700D型數(shù)碼凝膠掃描分析系統(tǒng)(上海，中國)
　　 (18)A-200Ds電子天平(美國)
　　 (19)超純水轉(zhuǎn)裝置(MILLIPORE MILLI-Q，美國)

7、r>　　 (20)實(shí)驗(yàn)室制冰機(jī)(ZIGERA2BE-70-35，德國)
　　 (21)恒溫震蕩培養(yǎng)箱(GFL，德國)
　　 (22)小型臺(tái)式離心機(jī)(SIGMA1-13，美國)
　　 (23)PH計(jì)(WTW InoLab，德國)
　　 (24)電動(dòng)高壓消毒鍋(HIRAYAMA HVE-50，美國)
　　 (25)倒置相差顯微鏡(OLYMPUS，日本)
　　 (26)JUNG-CM1800型

8、切片機(jī)(上海)
　　 (27)VITRO1250血液生化自動(dòng)分析儀(美國)
　　 (28)惠普監(jiān)測儀(美國)
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 本研究通過靜脈注射內(nèi)毒素制作ALI的模型，通過持續(xù)靜脈泵入多巴酚丁胺作為干預(yù)措施，機(jī)械通氣120分鐘后，通過分光光度儀，在波長620nm處測定Evans藍(lán)標(biāo)記的白蛋白濃度來測定不同組大鼠的肺泡液體清除率(AFC)；應(yīng)用Western-blot，測定大鼠肺組織水通道蛋白5(A

9、QP5)的表達(dá)；應(yīng)用RT-PCR的方法測定大鼠肺組織AQPSmRNA的含量；通過放射免疫的方法測定肺組織中環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的含量；比較各組數(shù)據(jù)之間的差異性。
　　 動(dòng)物模型制備：大鼠稱重，腹腔注射戊巴比妥鈉50mg/kg麻醉，仰臥位固定。氣管切開置入氣管插管，接動(dòng)物呼吸機(jī)。容量控制通氣，潮氣量10ml/kg，呼氣末正壓3cmH2O(1cmH2O=0.098kPa)，呼吸頻率35～50次/min，吸入氧濃度(FiO2)100

10、％。調(diào)節(jié)呼吸頻率，保持動(dòng)脈血二氧化碳分壓35～50 mmHg(1mmHg=0.133kPa)。維持動(dòng)脈收縮壓90～130mmHg，心率260～300次/min。分離股動(dòng)、靜脈，分別置入血管導(dǎo)管。靜脈注射內(nèi)毒素10 mg/kg，復(fù)制急性肺損傷模型。
　　 分組情況：按隨機(jī)數(shù)字法將動(dòng)物分為4組，正常對(duì)照組(實(shí)驗(yàn)開始時(shí)靜脈注射等量生理鹽水，Saline組)、多巴酚丁胺對(duì)照組(實(shí)驗(yàn)開始時(shí)靜脈持續(xù)注射多巴酚丁胺10μg/kg/min，Sa

11、line+Dobu組)，前兩組為非ALI組；急性肺損傷組(實(shí)驗(yàn)開始時(shí)靜脈注射內(nèi)毒素10mg/kg，LPS組)、多巴酚丁胺治療組(實(shí)驗(yàn)開始時(shí)靜脈注射內(nèi)毒素10mg/kg后，靜脈持續(xù)注射多巴酚丁胺10μg/kg/min，LPS+Dobu組)，為ALI組。循環(huán)穩(wěn)定20～30 min后，開始實(shí)驗(yàn)(0 h)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)束(120分鐘)，用腹主動(dòng)脈放血法處死大鼠，取材。
　　 結(jié)果：
　　 1、多巴酚丁胺對(duì)肺損傷大鼠的肺

12、泡液體清除率(AFC)的影響。
　　 在LPS組，肺泡液體清除率(AFC)是15.8±2.61％，而LPS+Dobu組的肺泡液體清除率(AFC)是25.2±3.5％。與LPS組相比，持續(xù)靜脈內(nèi)注射多巴酚丁胺能夠顯著的提高肺泡液體清除率(AFC)70％(Fig1 A)，P<0.01，在非ALI的Saline組和Saline+Dobu組，多巴酚丁胺對(duì)肺泡液體清除率(AFC)的影響并無差異(Fig1B)。
　　 2、多巴酚丁胺

13、對(duì)AQP5 mRNA和蛋白表達(dá)的影響
　　 RT-PCR顯示，在LPS組AQP5 mRNA水平與β-Actin比值為0.03±0.0022，而LPS+Dobu組是0.41±0.01，LPS+Dobu組的AQP5 mRNA的表達(dá)水平是對(duì)照組的13倍，P<0.01(Fig2A，通過Western-blot也證實(shí)，在LPS+Dobu組AQP5的蛋白表達(dá)顯著升高(Fig2C)；而在非ALI的Saline組和Saline+Dobu組相比較

14、，無論在基因水平還是在蛋白表達(dá)水平均無差異(Fig2B，2C)，Western-blot定量分析也證實(shí)了上述結(jié)果(Fig2D)。
　　 3、多巴酚丁胺對(duì)肺損傷大鼠肺組織的cAMP的表達(dá)。
　　 cAMP含量在LPS組大鼠肺組織的表達(dá)是22.3±7.6pmol/mg，而LPS+Dobu組是237.9±32.1pmol/mg。多巴酚丁胺顯著增加肺損傷大鼠的肺的cAMP的表達(dá)，LPS+Dobu組是LPS組的7倍，P<0.01(

15、Fig3A)。而在非ALI組多巴酚丁胺亦增加肺的cAMP的表達(dá)，但是Saline+Dobu組是Saline組的2倍，P<0.01，(Fig3B)。
　　 討論：
　　 大多數(shù)的ALI和ARDS的病人的肺泡液體清除功能受到損害，而良好的肺泡液體的清除往往提示著良好的預(yù)后。眾所周知，β腎上腺素能激動(dòng)劑能夠刺激肺泡上皮細(xì)胞鈉的轉(zhuǎn)運(yùn)和水的清除。作為一種臨床廣泛應(yīng)用的β腎上腺素能激動(dòng)劑，多巴酚丁胺能夠增加機(jī)械通氣大鼠的肺泡液體的清

16、除，我們的研究首次提示，在內(nèi)毒素所致的肺損傷大鼠的模型中，多巴酚丁胺可能通過調(diào)節(jié)AQP5表達(dá)和cAMP含量來增加肺泡液體清除率。
　　 我們認(rèn)為，在LPS+Dobu組肺損傷大鼠，AQP5蛋白表達(dá)的上調(diào)與多巴酚丁胺的處理有關(guān)。我們知道，AQP5對(duì)氣道粘膜下腺體的分泌有重要的影響，然而，雖然AQP5對(duì)氯和鈉的轉(zhuǎn)運(yùn)最初在囊性纖維化的研究中發(fā)現(xiàn)，但其分子層面的機(jī)制并不清楚。
　　 cAMP調(diào)節(jié)水通道蛋白的最明確的例子是腎臟細(xì)胞的

17、水通道蛋白2(AQP2)，而在水通道家族，AQP5的遺傳學(xué)特征與AQP2是最接近的。也有報(bào)道，cAMP調(diào)節(jié)肺泡上皮細(xì)胞AQP5的分布和濃度，而cAMP的水平受到β腎上腺素能激動(dòng)劑的調(diào)節(jié)。短期(數(shù)分鐘)暴露與cAMP，會(huì)產(chǎn)生AQP5的內(nèi)在關(guān)閉和細(xì)胞膜上豐度的下降，而長時(shí)間的暴露于cAMP則增加AQP5的分布與豐度。上述反應(yīng)均可被蛋白激酶A的抑制劑所阻斷。在我們的研究中，我們觀察到持續(xù)多巴酚丁胺處理2小時(shí)后cAMP的水平升高，顯示多巴酚丁胺

18、誘導(dǎo)了在體的cAMP的表達(dá)，這種多巴酚丁胺對(duì)cAMP-AQP5的調(diào)節(jié)作用，對(duì)于臨床ALI的治療可能具有重要的作用。
　　 我們的研究顯示，在內(nèi)毒素所致的肺損傷大鼠的模型中，持續(xù)靜脈注射多巴酚丁胺能夠增加AFC，增加AQP5和cAMP的表達(dá)，提示多巴酚丁胺對(duì)肺水清除(AFC)的影響可能通過cAMP和AQP5來完成，對(duì)上述機(jī)制的進(jìn)一步的研究，可能為ALI的進(jìn)一步的靶向治療提供幫助。
　　 結(jié)論：
　　 在內(nèi)毒素所致的