甲醛對肺泡液體清除率的作用及機(jī)制研究.pdf

1、肺水腫是由于某些因素誘發(fā)肺內(nèi)組織液的生成和回流平衡失調(diào)，使大量組織液異常積聚，從而造成肺通氣與肺換氣功能嚴(yán)重障礙。目前認(rèn)為，肺泡上皮細(xì)胞的肺泡液體清除（alveolar fluid clearance，AFC）作用對肺臟在生理和病理狀態(tài)下的液體平衡，例如急性肺損傷和成人呼吸窘迫綜合征等，起到非常重要的調(diào)控作用。在肺臟，位于肺上皮細(xì)胞頂側(cè)膜的上皮鈉通道(epithelial sodium channel，ENaC)是Na+重吸收的限速步驟

2、，同時也是肺泡發(fā)揮液體清除的主要方式，在控制氣液界面離子交換和粘膜纖毛擺動頻率方面發(fā)揮重要作用。香煙煙霧提取物中含有多種有害物質(zhì)，例如尼古丁、煙焦油、反應(yīng)性醛類、多環(huán)芳烴等。已有研究表明，吸煙可以誘導(dǎo)包括細(xì)胞凋亡、促炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激在內(nèi)的多種反應(yīng)，誘發(fā)多種呼吸系統(tǒng)疾病，例如肺氣腫、肺水腫、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructivepulmonary disease，COPD)等。甲醛是香煙煙霧的主要成分之一，我們推測其可

3、能通過抑制ENaC的活性或功能而降低AFC。本研究旨在探討甲醛與AFC之間的關(guān)系，明確甲醛是否通過影響肺泡上皮Na+轉(zhuǎn)運(yùn)影響AFC，并探討其可能的分子機(jī)制。
　　目的：
　　一、檢測甲醛刺激對在體小鼠AFC的影響。
　　二、檢測甲醛對人肺腺癌NCl-H441單層細(xì)胞短路電流的影響，通過實(shí)時測定不同濃度甲醛刺激后H441單層細(xì)胞的短路電流，分析甲醛對ENaC功能的影響。
　　三、檢測在H441細(xì)胞中，甲醛對細(xì)胞外調(diào)

4、節(jié)蛋白激酶（extracellular regulatedprotein kinases，ERK)1/2的蛋白表達(dá)水平的影響。
　　四、檢測在H441細(xì)胞中，甲醛刺激對ENaC蛋白水平及mRNA水平表達(dá)的影響。
　　五、檢測甲醛對H441細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平的影響。
　　方法：
　　一、應(yīng)用在體小鼠AFC檢測技術(shù)檢測甲醛對在體小鼠AFC的影響。
　　二、

5、應(yīng)用尤斯灌流（Ussing chamber）技術(shù)檢測甲醛對H441單層細(xì)胞短路電流的影響。
　　三、應(yīng)用免疫印跡（western blot）法研究甲醛對ERK1/2蛋白磷酸化的影響。
　　四、應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)和Western blot檢測甲醛對體外培養(yǎng)的H441細(xì)胞ENaC蛋白及mRNA水平表達(dá)的影響。

6、>　　五、應(yīng)用活性氧檢測試劑盒(ROS Kit)檢測甲醛對細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響。
　　結(jié)果：
　　一、氣管插管注入甲醛后，小鼠AFC被顯著抑制，其抑制程度弱于特異性鈉通道阻斷劑阿米洛利。
　　二、甲醛能夠劑量依賴性地抑制H441單層細(xì)胞的阿米洛利敏感性電流，其半數(shù)抑制濃度為165.6μM。
　　三、甲醛能夠顯著促進(jìn)ERK1/2蛋白磷酸化，該促進(jìn)作用在30分鐘時效果最強(qiáng)。以絲裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-

7、activated protein kinase kinase，MAPKK)抑制劑PD98059預(yù)處理H441細(xì)胞，Western blot結(jié)果顯示甲醛對ERK1/2蛋白磷酸化的促進(jìn)作用被明顯抑制。
　　四、甲醛處理H441細(xì)胞不同時間，與空白對照組相比，α-ENaC蛋白水平在12小時顯著下降，24小時達(dá)到最低。α-ENaC和γ-ENaC mRNA水平的表達(dá)隨甲醛刺激時間的增加先下降后上升，最后趨于穩(wěn)定。
　　五、甲醛能夠顯

8、著提高H441細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，其促進(jìn)作用隨刺激時間的增加而增加。
　　結(jié)論：
　　一、甲醛能夠抑制在體小鼠的AFC，可能誘發(fā)肺水腫。
　　二、甲醛能降低阿米洛利敏感性電流，這可能與減弱ENaC的活性有關(guān)。
　　三、甲醛能夠促進(jìn)ERK1/2蛋白磷酸化，該促進(jìn)作用可以被MAPKK抑制劑PD98059抑制。
　　四、甲醛能夠抑制α-ENaC蛋白水平的表達(dá)，并對α-ENaC和γ-ENaC mRNA水平表達(dá)有抑制