mTORC2-SGK1通路在胰島素上調(diào)急性肺損傷ENaC介導(dǎo)的肺泡液體清除的作用研究.pdf

1、背景:急性肺損傷（ALI）和急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）以肺水腫和頑固低氧血癥為臨床特點(diǎn)，死亡率高達(dá)40％。促進(jìn)肺泡上皮鈉通道（ENaC）介導(dǎo)的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)能夠加速肺水腫的吸收，從而改善氧合。胰島素已被證實(shí)參與ALI時(shí)肺泡液體清除（AFC）過程，但是，其具體調(diào)控機(jī)制目前尚未完全闡明。
　　目的:通過建立脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的ALI模型，觀察胰島素對(duì)ALI小鼠AFC和ENaC的作用，并探討血清糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)激酶-1（SGK1）在胰島

2、素信號(hào)中的作用；同時(shí)通過原代分離純化的2型肺泡上皮（AT2）細(xì)胞，進(jìn)一步探討胰島素活化SGK1進(jìn)而調(diào)控ENaC的信號(hào)機(jī)制，為臨床上ALI/ARDS肺水腫的治療提供理論依據(jù)。
　　方法:
　?。?）40只小鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組（Control），LPS組（LPS），LPS+胰島素組（LI）和EMD638683+LPS+胰島素組（ELI）。ELI組小鼠連續(xù)2天以EMD638683（20mg/kg·d-1）灌胃，余小組以等量生理

3、鹽水灌胃。第2天灌胃后，LPS組、LI組及ELI組小鼠經(jīng)氣管插管向氣管內(nèi)注入LPS（5mg/kg溶于50μL生理鹽水），對(duì)照組小鼠注入等量生理鹽水。6h后，LI組及ELI組小鼠經(jīng)尾靜脈注入胰島素（0.1U/kg溶于0.2mL5%葡萄糖注射液），對(duì)照組與LPS組則注入等量生理鹽水。胰島素作用6h后麻醉各組小鼠，收集氣管及肺組織。每組隨機(jī)抽取5只，左肺行肺濕/干重比（W/D）檢測(cè)，右肺行AFC檢測(cè)；余5只采用HE染色及透射電鏡評(píng)估肺組織病理

4、學(xué)改變、免疫組織化學(xué)分析檢測(cè)肺組織ENaC表達(dá)及分布情況、蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)肺組織ENaC蛋白表達(dá)水平變化。
　?。?）原代分離純化小鼠2型肺泡上皮（AT2）細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞爬片，分為3組：①對(duì)照組：無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)2.5h；②胰島素組：無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)30min后加100nM胰島素繼續(xù)培養(yǎng)2h；③胰島素+GSK650394組：含1μM GSK650394的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)30min后加100nM胰島素

5、繼續(xù)培養(yǎng)2h。細(xì)胞爬片處理后行激光共聚集掃描檢測(cè)ENaC蛋白表達(dá)水平變化。
　?。?）原代分離純化的小鼠AT2細(xì)胞隨機(jī)分為6組：①對(duì)照組：無血清培養(yǎng)基；②胰島素組：無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)30min后加入100nM胰島素；③LY294002+胰島素組：含10μM LY294002的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)30min后加入胰島素100nM；④PP242+胰島素組：含1μM PP242的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)30min后加入胰島素100nM；⑤雷帕霉素+胰

6、島素組：含0.1μM雷帕霉素的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)30min后加入胰島素100nM；⑥GSK650394+胰島素組：含1μM GSK650394的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)30min后加入胰島素100nM；胰島素作用2h后收集細(xì)胞，Western blot檢測(cè)肺組織ENaC蛋白表達(dá)水平、SGK1磷酸化水平，并采用免疫共沉淀檢測(cè)mTORC與SGK1的相互作用。
　　（4）20只小鼠隨機(jī)分為4組：LPS組（LPS）、LPS+胰島素組（LI）、PP2

7、42+LPS+胰島素組（PLI）及雷帕霉素組+LPS+胰島素（RLI）。PLI組及RLI組小鼠經(jīng)腹腔分別給予PP242（20mg/kg）或雷帕霉素（5mg/kg），LPS組及LI組則給予等量DMSO；30min各組小鼠后行氣管插管并向氣管內(nèi)注入LPS（5mg/kg溶于50μL生理鹽水）；6h后LI組、PLI組及RLI組小鼠經(jīng)尾靜脈注入胰島素（0.1U/kg溶于0.2mL5%葡萄糖注射液），LPS組小鼠則注入0.2mL生理鹽水。6h后收集

8、氣管及肺組織，檢測(cè)AFC、ENaC蛋白表達(dá)水平和SGK1磷酸化水平。
　　結(jié)果:
　?。?）與對(duì)照組相比，LPS組肺損傷評(píng)分明顯增加，肺泡上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)顯著病理性改變；胰島素能夠減輕LPS誘導(dǎo)的肺組織損傷，并顯著減輕肺水腫程度；而SGK1抑制劑能夠顯著抑制胰島素促進(jìn)肺水腫吸收的效應(yīng)。同時(shí)，LPS組AFC明顯降低，W/D顯著增加，α-，β-和γ-ENaC蛋白表達(dá)水平也顯著降低，胰島素顯著增加AFC，降低W/D，并上調(diào)α-

9、，β-和γ-ENaC蛋白表達(dá)水平，而SGK1抑制劑顯著、但并不完全地抑制了胰島素的效應(yīng)。
　　（2）α-，β-和γ-ENaC主要表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞胞膜上；胰島素使α-，β-和γ-ENaC表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高；SGK1抑制劑使胰島素上調(diào)α-，β-和γ-ENaC的作用明顯減弱。
　?。?）胰島素作用于肺泡上皮細(xì)胞后，SGK1磷酸化水平和α-，β-和γ-ENaC蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)；分別給予LY294002、PP242和SGK

10、1抑制劑后，胰島素誘導(dǎo)的SGK1磷酸化水平和α-，β-和γ-ENaC蛋白表達(dá)水平顯著下降，而雷帕霉素對(duì)胰島素的效應(yīng)無明顯影響。免疫共沉淀提示SGK1與mTORC2組成成分Rictor、SIN1結(jié)合，而并不與mTORC1組成成分Raptor結(jié)合，并且胰島素可使SGK1-Rictor和SGK1-SIN1結(jié)合增加。
　　（4）在ALI小鼠，PP242顯著抑制了胰島素誘導(dǎo)的AFC上調(diào)、SGK1磷酸化和α-，β-和γ-ENaC蛋白表達(dá)增加的