HAP1通過介導(dǎo)胰島素分泌顆粒與KIF5B的相互作用調(diào)節(jié)胰島素分泌顆粒在胰島β細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸.pdf

1、亨廷頓蛋白相關(guān)蛋白1（Huntingtin associated protein1，HAP1）作為一種與亨廷頓?。℉untington’s disease，HD）致病基因產(chǎn)物亨廷頓蛋白（huntingtin，htt）結(jié)合的蛋白，不僅在神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)，也存在于包括胰島在內(nèi)的內(nèi)分泌系統(tǒng)中。在胰島內(nèi)，HAP1選擇性表達(dá)于分泌胰島素的β細(xì)胞。HAP1具有HAP1A和HAP1B兩種可變剪切體，二者在羧基末端的氨基酸序列不同，但在腦內(nèi)和內(nèi)分泌系統(tǒng)的表

2、達(dá)模式基本相似。利用小分子干擾RNA（Small interfering RNA，SiRNA）沉默胰島β細(xì)胞系內(nèi)HAP1表達(dá)及敲除小鼠胰島內(nèi)HAP1的研究顯示，HAP1參與β細(xì)胞胰島素分泌即沉默或敲除HAP1后，β細(xì)胞的胰島素分泌明顯減少。但HAP1影響胰島素分泌的機(jī)制不明。
　　在神經(jīng)元內(nèi)，HAP1可作為連接微管馬達(dá)蛋白與被轉(zhuǎn)運(yùn)物的銜接蛋白或相關(guān)蛋白，參與轉(zhuǎn)運(yùn)物在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸。HAP1尤其是HAP1A可通過與驅(qū)動蛋白輕鏈(KLC

3、)和重鏈(KHC)、動力蛋白激活蛋白(dynactin，動力蛋白的輔助因子)復(fù)合物的亞單位P150Glued(一種介導(dǎo)動力蛋白激活蛋白與微管結(jié)合的蛋白質(zhì))等微管馬達(dá)蛋白及相關(guān)蛋白的相互作用參與或調(diào)控神經(jīng)元內(nèi)小泡、神經(jīng)營養(yǎng)因子、受體蛋白等成份基于微管的胞內(nèi)運(yùn)輸。細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸分為依賴微絲或肌動蛋白絲的運(yùn)輸和依賴微管的運(yùn)輸。對內(nèi)分泌細(xì)胞分泌顆粒而言，微絲依賴性運(yùn)輸主要與突觸小泡/分泌顆粒短距離運(yùn)輸如從儲存池向細(xì)胞膜上的募集有關(guān)，主要影響胰島

4、素的第Ⅰ相分泌；微管依賴性運(yùn)輸主要與分泌顆粒的長距離運(yùn)輸(包括從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基復(fù)合體、從高爾基復(fù)合體向儲存池的運(yùn)輸)有關(guān)，主要影響胰島素的第Ⅱ相分泌。HAP1是否參與調(diào)節(jié)胰島素分泌顆粒的運(yùn)輸而影響胰島素的分泌，目前未見報(bào)道。胰島素分泌顆粒Ⅱ相的微管依賴性運(yùn)輸由驅(qū)動蛋白的KHC（又稱KIF5）介導(dǎo)，在鼠類，KIF5有KIF5A、KIF5B、KIF5C三種形式，而KIF5A和KIF5B分別是人類的神經(jīng)元和廣泛分布KHC的同型物，KIF5B在

5、胰腺β細(xì)胞中高表達(dá)。因此胰島素第Ⅱ相分泌顆粒運(yùn)輸主要由 KIF5B介導(dǎo)。但HAP1是否通過介導(dǎo)胰島素分泌顆粒與其馬達(dá)蛋白的相互作用而調(diào)節(jié)胰島素分泌顆粒在胞內(nèi)的運(yùn)輸也未見報(bào)道。
　　為了明確HAP1是否通過影響胰島素或其分泌顆粒的胞內(nèi)運(yùn)輸調(diào)節(jié)胰島素的分泌，本研究在大鼠胰島β細(xì)胞瘤細(xì)胞系INS-1細(xì)胞中，觀察了沉默HAP1對胰島素分泌顆粒胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)挠绊懀⒎治鯤AP1表達(dá)水平對胰島素分泌顆粒及其運(yùn)輸所依賴的驅(qū)動蛋白KIF5B之間相互作

6、用的影響。
　　一、HAP1表達(dá)水平影響高糖刺激所致的胰島素或其分泌顆粒在INS-1細(xì)胞周邊的定位
　　為了證明HAP1通過參與胰島素或其分泌顆粒的胞內(nèi)運(yùn)輸而影響胰島素的分泌，首先觀察低表達(dá)HAP1是否影響高糖刺激所致的胰島素或其分泌顆粒在INS-1細(xì)胞的周邊的定位，結(jié)果表明，沉默INS-1細(xì)胞內(nèi)HAP1后，能顯著減少高糖刺激引起的胰島素或其分泌顆粒在細(xì)胞周邊的分布。
　　1.沉默HAP1使定位在INS-1細(xì)胞胞質(zhì)周邊

7、的胰島素減少將INS-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染HAP1 SiRNA后，用含葡萄糖3 mmol/L的林二氏重碳酸鹽緩沖液（Krebs-Ringer-Hepes–bicarbonate buffer KRHB）孵育2 h，再用含30 mmol/L葡萄糖的KRHB刺激1 h，固定細(xì)胞后免疫熒光標(biāo)記胰島素并在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察胰島素分布的情況。與轉(zhuǎn)染SiRNA對照質(zhì)粒的INS-1細(xì)胞比較，沉默HAP1使胰島素彌散性分布在細(xì)胞內(nèi)而在近細(xì)胞膜的周邊胞質(zhì)部

8、位明顯減少。由于改變HAP1的表達(dá)水平并不影響胰島素的表達(dá)，因此，沉默HAP1減少細(xì)胞周邊部位的胰島素可能是胰島素向周邊的運(yùn)輸減少所致。
　　2.沉默HAP1減少胰島素分泌顆粒在細(xì)胞周邊的定位胰島素是由胰島素分泌顆粒運(yùn)輸至細(xì)胞膜處并胞吐到細(xì)胞外。為了分析HAP1是否影響胰島素分泌顆粒的胞內(nèi)運(yùn)輸，在INS-1細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染HAP1 SiRNA和對照質(zhì)粒，48 h后用含3 mmol/L葡萄糖的KRH緩沖液培養(yǎng)2 h再用含30 mmol

9、/L KRH緩沖液刺激1 h。對胰島素分泌顆粒特征性膜蛋白phogrin的免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒的細(xì)胞中，phogrin免疫熒光標(biāo)記信號在近細(xì)胞膜的胞質(zhì)部位分布較多，而在轉(zhuǎn)染HAP1 SiRNA的細(xì)胞中，phogrin陽性信號分布較彌散，在近細(xì)胞膜的周邊部胞質(zhì)內(nèi)定位明顯減少。在轉(zhuǎn)染表達(dá)phogrin-EGFP的INS-1細(xì)胞內(nèi)，沉默HAP1使phogrin-EGFP成團(tuán)分布于近核胞質(zhì)內(nèi)，近細(xì)胞膜的周邊部分布較轉(zhuǎn)染對照SiRNA

10、質(zhì)粒的細(xì)胞明顯減少。而RT-PCR及Western Blot技術(shù)檢測顯示，沉默HAP1不改變phogrin的表達(dá)。由此進(jìn)一步證明，沉默HAP1可使胰島素分泌顆粒向細(xì)胞膜周邊的運(yùn)輸減少。
　　二、HAP1表達(dá)水平影響INS-1細(xì)胞中分泌顆粒運(yùn)輸速度
　　為了為HAP1參與胰島β細(xì)胞內(nèi)分泌顆粒運(yùn)輸提供直接證據(jù)，進(jìn)一步檢測了HAP1表達(dá)水平對INS-1細(xì)胞中分泌顆粒運(yùn)輸速度的影響，觀察到沉默HAP1可顯著抑制INS-1細(xì)胞中分泌顆

11、粒的運(yùn)輸。
　　1.沉默HAP1降低胰島素分泌顆粒胞內(nèi)運(yùn)輸速度將HAP1 SiRNA質(zhì)?；蚱鋵φ辗謩e與pEGFP-phogrin質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染INS-1細(xì)胞后，在激光掃錨共聚焦顯微鏡下用熒光漂白后恢復(fù)（fluoscence recovery after photographbleach，F(xiàn)RAP）技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，在沉默HAP1的INS-1細(xì)胞內(nèi)，漂白后的EGFP-phogrin熒光強(qiáng)度恢復(fù)速度較對照細(xì)胞明顯減慢，即EGFP-phogri

12、n標(biāo)記的胰島素分泌顆粒在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸速度明顯降低。
　　2.降低HAP1表達(dá)抑制轉(zhuǎn)染表達(dá)的皰疹性口腔炎病毒糖蛋白在INS-1細(xì)胞中的運(yùn)輸速度重組表達(dá)的皰疹性口腔炎病毒糖蛋白（vesicular stomatitis viralglycoprotein，VSVG）在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)合成后，當(dāng)溫度為40℃時(shí)便可逆性錯誤折疊并滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，而當(dāng)溫度降為32℃時(shí)，則恢復(fù)正常折疊并移出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，以微管依賴性運(yùn)輸方式移向細(xì)胞膜或近細(xì)胞膜的周邊胞質(zhì)。本

13、研究中，當(dāng)把表達(dá)VSVG-EGFP融合蛋白的質(zhì)粒與HAP1 SiRNA質(zhì)?；蚱鋵φ召|(zhì)粒共轉(zhuǎn)染INS-1細(xì)胞后，應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡動態(tài)觀察比較沉默HAP1對VSVG-EGFP溫度敏感的微管依賴性運(yùn)輸速度的影響。結(jié)果顯示，在40℃培養(yǎng)時(shí)，兩組細(xì)胞內(nèi)的VSVG-EGFP均呈聚集狀滯留于近細(xì)胞核胞質(zhì)；當(dāng)把培養(yǎng)溫度降為32℃培養(yǎng)3 h后，轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒的細(xì)胞內(nèi)近核處的聚集狀VSVG-EGFP減少，而在細(xì)胞膜上或近細(xì)胞膜周邊胞質(zhì)彌散狀VSVG-

14、EGFP增加，但在HAP1沉默組細(xì)胞，VSVG-EGFP仍主要呈聚集狀滯留于核周胞質(zhì)；32℃培養(yǎng)5 h后，轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒的細(xì)胞內(nèi)近核處的聚集狀VSVG-EGFP進(jìn)一步減少，細(xì)胞膜上或近細(xì)胞膜周邊胞質(zhì)彌散狀VSVG-EGFP進(jìn)一步增加，而HAP1沉默組細(xì)胞內(nèi)VSVG-EGFP仍主要呈滯留于細(xì)胞核周胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞膜上或細(xì)胞周邊部仍然極少有彌散VSVG-EGFP。由此證明HAP1參與胰島β細(xì)胞中分泌顆粒的微管依賴性運(yùn)輸。
　　三、HAP1介

15、導(dǎo)INS-1細(xì)胞內(nèi)胰島素分泌顆粒與微管馬達(dá)蛋白KIF5B的相互作用KIF5B介導(dǎo)鼠類胰島β細(xì)胞內(nèi)胰島素或其分泌顆粒的微管依賴性運(yùn)輸。為了明確HAP1是否作為胰島素分泌顆粒與KIF5B之間的銜接蛋白或相關(guān)蛋白參與胰島素分泌顆粒的運(yùn)輸，繼而對HAP1、胰島素分泌顆粒和KIF5B之間相互作用進(jìn)行了分析。對野生型INS-1細(xì)胞進(jìn)行免疫共沉淀分析顯示，HAP1既能與phogrin結(jié)合，也能與KIF5B結(jié)合，KIF5B還能與phogrin結(jié)合，表明

16、HAP1、phogrin和KIF5B三者之間均存在相互作用。當(dāng)把INS-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染HAP1SiRNA質(zhì)?；蚱鋵φ召|(zhì)粒后再進(jìn)行免疫共沉淀分析，發(fā)現(xiàn)沉默HAP1后phogrin與KIF5B的結(jié)合減少，即沉默HAP1能顯著抑制phogrin與KIF5B之間的相互作用。
　　結(jié)論：HAP1參與胰島β細(xì)胞中胰島素或其分泌顆粒的胞內(nèi)微管依賴性運(yùn)輸，HAP1與胰島素分泌顆粒和其基于運(yùn)輸?shù)奈⒐荞R達(dá)蛋白KIF5B之間相互作用。HAP1介導(dǎo)胰島素分泌