曲美他嗪通過(guò)mTORC2-SGK1通路對(duì)脂多糖所致急性肺損傷的治療作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景：
　　急性肺損傷(acute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome)是以肺內(nèi)彌漫性炎細(xì)胞浸潤(rùn)、肺組織循環(huán)障礙、肺毛細(xì)血管通透性增加及低氧血癥為特點(diǎn)的臨床綜合征，目前是呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)、難點(diǎn)，預(yù)后極差，病情兇險(xiǎn)，可迅速進(jìn)展為多器官功能不全，為此防治本類疾病對(duì)臨床有重要意義。目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)進(jìn)行了一系列的基礎(chǔ)與臨床實(shí)驗(yàn)研究，但未闡

2、明ALI/ARDS的發(fā)病機(jī)制。如果能有效地清除肺泡腔內(nèi)過(guò)多的水腫液，對(duì)維持患者氣體交換和改善氧合指數(shù)非常重要，同時(shí)可降低此類患者的病死率和死亡率。肺泡上皮鈉通道(epithelial sodium channel, ENaC)是肺泡腔內(nèi)鈉水轉(zhuǎn)運(yùn)和推動(dòng)水腫液清除的重要環(huán)節(jié)，是完成肺泡腔內(nèi)鈉離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的限速步驟和提供肺泡清除(alveolar fluid clearance, AFC)的源動(dòng)力，亦協(xié)同鈉/鉀ATP酶共同完成鈉水轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，在

3、肺泡清除中發(fā)揮重要的作用。
　　初始有關(guān) ALI/ARDS的研究主要集中在炎癥假說(shuō)方面，比如糖皮質(zhì)激素、自由基清除劑、抗氧化劑及肺泡表面活性物質(zhì)等，并涉及如下機(jī)制調(diào)控（如圖-2所示），通過(guò)支持、抗炎及輔助通氣等綜合治療后仍存在療效不滿意或產(chǎn)生不良反應(yīng)。因此，解決某一方面的問(wèn)題很難對(duì)疾病的治療起到根本性作用。
　　治療ALI/ARDS的關(guān)鍵步驟是把過(guò)多的水腫液排除到肺泡腔外，來(lái)推動(dòng)肺水清除，這對(duì)維持氣體交換和恢復(fù)氧合指標(biāo)具有重

4、要的指導(dǎo)意義。肺泡上皮細(xì)胞本身具有清除過(guò)多液體的能力，脂多糖內(nèi)毒素誘發(fā)的損傷是引起ALI/ARDS水腫液聚集的重要因素。本研究擬通過(guò)SGK1途徑在保護(hù)肺泡上皮細(xì)胞的同時(shí)可增強(qiáng)肺泡水腫液清除(AFC)，對(duì)臨床治療ALI/ARDS具有重要的意義，為探索ENaC在AFC的作用機(jī)制更具有一定的臨床實(shí)用價(jià)值，亦為尋找一種有效調(diào)控ENaC及上游信號(hào)通路的藥物提供新的治療靶點(diǎn)。
　　mTOR是絲氨酸-蘇氨酸的高度保守序列，在細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝及存活

5、過(guò)程中發(fā)揮核心控制作用[12]。根據(jù)mTOR結(jié)構(gòu)、功能以及對(duì)雷帕霉素敏感性的不同可分為mTOR復(fù)合物1（mTORC1）和mTOR復(fù)合物2（mTORC2）兩條不同的信號(hào)通路。其中mTORC2屬于PIKK家族成員，在調(diào)節(jié)鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白翻譯等過(guò)程中起重要的調(diào)節(jié)作用[13]。同時(shí)亦是來(lái)自上游的細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)向下游轉(zhuǎn)導(dǎo)的感應(yīng)器[20]，對(duì) ENaC具有正調(diào)節(jié)功能。
　　曲美他嗪是一種心肌保護(hù)藥，在心臟中的研究甚多[8]，是通過(guò)其抑制脂肪酸β

6、氧化[9]，促進(jìn)葡萄糖有氧氧化[10]，來(lái)降低產(chǎn)生ATP所需的氧耗及產(chǎn)生高能鍵，亦具有清除自由基、穩(wěn)定細(xì)胞膜的作用。研究發(fā)現(xiàn)此藥在急性胰腺炎中能炎性介質(zhì)IL-1a、IL-6及TNF-a水平明顯降低，有利于保護(hù)胰腺組織[21]。其作用機(jī)制是通過(guò)活化細(xì)胞膜表面的ATP酶，抑制氧化應(yīng)激（ROS）及影響 mTORC通路來(lái)發(fā)揮藥理學(xué)作用。此藥在急性肺損傷中的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道，本課題擬用曲美他嗪干預(yù)mTORC2/SGK1信號(hào)通路來(lái)觀察對(duì)LPS所致

7、急性肺損傷的療效，為臨床治療ALI/ARDS提供一種新的治療途徑。
　　目的：
　　從體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)兩個(gè)層面研究曲美他嗪干預(yù)ALI/ARDS模型，觀察其能否調(diào)控mTORC2/SGK1信號(hào)通路及對(duì)ENaC作用的分子機(jī)理，為ALI/ARDS發(fā)病機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)和對(duì)治療提供新思路。
　　方法：
　　本實(shí)驗(yàn)由三部分組成
　　1.第一部分：從體外實(shí)驗(yàn)探討 mTORC2/SGK1信號(hào)通路對(duì) ENaC的影響
　　

8、通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)mTORC2/SGK1信號(hào)通路對(duì)ENaC活性的影響；采用ELISA檢測(cè)炎性因子和WB、免疫熒光等方法說(shuō)明該通路對(duì)ENaC各亞基的表達(dá)。
　　2.第二部分：通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)mTORC2/SGK1信號(hào)通路對(duì)ENaC活性的影響，來(lái)觀察該通路對(duì)ENaC各亞基的表達(dá)。
　　通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)mTORC2/SGK1信號(hào)通路對(duì)ENaC活性的影響；采用ELISA、WB、免疫組化及干/濕重等手段檢測(cè)該通路對(duì)ENaC的表

9、達(dá)。
　　3．第三部分：曲美他嗪對(duì) LPS所致肺損傷中 mTORC2/SGK1信號(hào)通路保護(hù)機(jī)制的相關(guān)研究
　　通過(guò)曲美他嗪干預(yù)LPS所致急性肺損傷中mTORC2/SGK1信號(hào)通路及觀察對(duì) ENaC各亞基的表達(dá)，為臨床治療該病提供一種新的思路和方法。
　　結(jié)果：
　　1.從體外實(shí)驗(yàn)探討 mTORC2/SGK1信號(hào)通路對(duì) ENaC各亞基的表達(dá)
　　我們利用促炎介質(zhì) IL-6,IL-8和 TNF-α作為急性肺損傷

10、/急性呼吸窘迫綜合征惡化的炎性調(diào)節(jié)器。收集細(xì)胞上清液通過(guò) ELISA法測(cè)定IL-6、IL-8及TNF-α。我們發(fā)現(xiàn)在體外建立的ALI模型中IL-6、IL-8和TNF-α分泌均是增加的。
　　2.從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討mTORC2/SGK1信號(hào)通路對(duì)ENaC的影響
　　由于ENaC在 mTORC2/SGK1信號(hào)通路的下游,據(jù)報(bào)道m(xù)TOR在ALI/ARDS中起重要的作用[1-3]。這個(gè)證據(jù)促使我們假設(shè)mTORC2/SGK1信號(hào)通路能調(diào)節(jié)

11、ENaC。我們采用 W-B測(cè)定 mTOR和SGK1蛋白水平來(lái)驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)是成立的。結(jié)果表明：mTORC2/SGK1信號(hào)通路能調(diào)節(jié)ENaC的各亞基。
　　3.曲美他嗪對(duì)LPS所致肺損傷中mTORC2/SGK1信號(hào)通路保護(hù)機(jī)制的相關(guān)研究
　　在脂多糖誘導(dǎo)組等離子體膜中ENAC各亞基的表達(dá)降低，經(jīng)曲美他嗪治療后各亞基恢復(fù)正常；炎性因子的分泌明顯減少，表明曲美他嗪不僅能減輕炎癥反應(yīng)，而且通過(guò)增加ENAC各亞基的表達(dá)來(lái)提高Na+轉(zhuǎn)運(yùn)，

12、進(jìn)而減輕肺水腫；在脂多糖誘導(dǎo)細(xì)胞組曲美他嗪能上調(diào)mTOR,并通過(guò)其增加SGK1的表達(dá),表明此藥能調(diào)節(jié)mTORC2/SGK1通路；脂多糖治療的小鼠干/濕重比是顯著增加的,然而,通過(guò)曲美他嗪治療后其比值降低(與藥物濃度呈正比)。
　　結(jié)論：
　　1.從體內(nèi)外急性肺損傷模型中曲美他嗪能減輕肺損傷和肺水腫,故為此病的治療提供一個(gè)新的治療途徑。
　　2.在脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞、動(dòng)物模型中，曲美他嗪能通過(guò)減少促炎細(xì)胞因子的分泌來(lái)減輕急