膠質細胞生長因子-2在顱腦損傷中作用的研究及其基因重組蛋白制備.pdf

1、目的 明確膠質細胞生長因子-2(GGF2)在顱腦損傷恢復中的作用，探討顱腦損傷后GGF2轉基因治療的可行性，原核表達并純化GGF2重組蛋白。膠質細胞生長因子-2(glialgrowthfactor2，GGF2)是neuregulin基因的產物之一。GGF2與erbB受體家族成員的異二聚體或同二聚體結合，在發(fā)育及成熟的神經系統(tǒng)中發(fā)揮廣泛而重要的生理作用。GGF2對于神經元的發(fā)育、分布，膠質細胞譜系的形成，突觸結構的形成，神經肌肉

2、接頭的形成等均起重要作用。體外研究發(fā)現GGF2可促進神經元的存活，促進少突膠質細胞的增殖和存活，促進雪旺氏細胞的增殖和分化。已發(fā)現GGF2對多種神經系統(tǒng)病變的恢復有促進作用，如多發(fā)性硬化、順鉑誘發(fā)的神經功能障礙、坐骨神經擠壓傷等。 該研究期望證明GGF2可促進顱腦損傷的恢復，并探討GGF2轉基因治療顱腦損傷的可行性。該文還將通過原核表達的方法獲得GGF2重組蛋白，供將來進一步研究之用。 第一部分 大鼠液壓腦損傷

3、模型中膠質細胞生長因子-2及其受體mRNA的表達變化 目的 研究大鼠液壓腦損傷后GGF2及其受體erbB2、erbB3和erbB4mRNA在傷側皮層，海馬CA1、CA2、CA3區(qū)及齒狀回(DG)的表達變化規(guī)律。 方法 RT-PCR方法獲得總cDNA。設計四對特異性引物，分別針對GGF2mRNA全長序列、erbB2、erbB3和erbB4mRNA序列中特異性片斷，PCR擴增。擴增序列插入pBluescrip

4、tⅡSK(-)質粒，構建探針標記用克隆。探針質粒線形化后，利用T3RNA聚合酶體外轉錄法獲得四種地高辛探針。Dotblot鑒定探針及明確探針滴度。成年SD大鼠隨機分為6組，側方液壓打擊(LFP)致傷，原位雜交方法分別研究打擊前，打擊后1h、6h、24h、72h、168h(7d)目的mRNA的表達情況，研究腦區(qū)包括傷側皮層、海馬CA1、CA2、CA3區(qū)及DG。 結果 經測序鑒定成功構建了四種探針克隆。成功標記四種探針，并且

5、明確了探針滴度。大鼠LFP模型制作一致性好。原位雜交切片陽性信號強，背景弱，效果佳。雜交結果分析表明：在成年大鼠腦組織中，GGF2、erbB2、erbB3和erbB4mRNA均有表達，表達細胞均包括神經元及膠質細胞。在給予LFP損傷后，目的mRNA在致傷后6小時均出現表達下降，在傷后1天，表達水平基本恢復至傷前水平。GGF2mRNA在傷后3天，在各腦區(qū)表達明顯增加，傷后7天表達水平稍有下降，但仍高于傷前。各受體mRNA在傷后3-7天表達

6、量在各腦區(qū)均無明顯變化。 結論 大鼠LFP致傷后3-7天，GGF2mRNA在傷側海馬CA1區(qū)、CA2區(qū)、CA3區(qū)、DG及皮層表達明顯增加，其受體mRNA表達量在傷側各腦區(qū)均無明顯變化。 第二部分 大鼠液壓腦損傷后陽離子脂質體介導GGF2轉基因治療 目的 觀察大鼠LFP腦損傷后GGF2轉基因治療的效果，進一步明確GGF2的神經營養(yǎng)作用，探討顱腦損傷后基因治療的可行性。 方法

7、 PCR擴增，得到GGF2基因全長序列，插入pEGFP-N1載體，構建pEGFP-N1-GGF2真核表達質粒。以不同配比的陽離子脂質體/質?；旌衔锓謩e腦內直接注射轉染LFP大鼠腦組織，明確最佳配比和轉染時相。大鼠完全隨機分為4組，分別為pEGFP-N1-GGF2+脂質體治療組，空載體+脂質體對照組，單純脂質體對照組和假手術組。大鼠致傷后給予相應治療，行為學測定觀察預后。觀察項目包括爬坡實驗、平衡實驗和行走實驗，傷前測基礎值，傷后連續(xù)10

8、天測定。傷后第10天處死大鼠取標本，行HE染色、尼氏染色及MBP、NSE、GFAP免疫組化染色。 結果 測序鑒定成功構建pEGFP-N1-GGF2真核表達質粒。明確了脂質體：質粒(μl：μg)為3：1時GGF2可獲最大表達量。表達從轉染后6h開始，3d后表達量達到最高，7d后仍高，14d時明顯下降。行為學測定表明pEGFP-N1-GGF2+脂質體治療組預后優(yōu)于對照組，以行走實驗改善最為明顯。組織學觀察表明治療組在傷側皮層

9、、海馬神經元計數優(yōu)于對照組，傷側皮層、皮層下白質MBP染色信號強度優(yōu)于對照組。 結論 GGF2在顱腦損傷后有神經營養(yǎng)作用，陽離子脂質體轉染法GGF2轉基因治療顱腦損傷有臨床應用前途。 第三部分 GGF2的重組表達、純化 目的 通過原核表達的方法得到GGF2重組蛋白。 方法 亞克隆的方法將不含信號肽編碼序列的GGF2基因自PVT-GGF2質?？寺≈罰CXJ18質粒，再由PC

10、XJ18-GGF2質?？寺≈罰ET-32(b)質粒，構建pET-32b(+)-GGF2表達載體。表達載體轉染四種宿主菌，篩選合適者。優(yōu)化表達時程和IPTG誘導劑量。GGF2大量表達后回收包涵體，復性。復性產物利用Ni·IDAHis·Bind樹脂進一步純化。純化產物Westernblot鑒定。 結果 測序鑒定成功構建pET-32b(+)-GGF2表達載體。篩選結果表明OrigamiB(DE3)為合適宿主菌。適宜的表達條件為