重組HPPCn蛋白的制備及其在腦缺血損傷中的作用初探.pdf

1、本實驗室的研究人員分離到一個能夠促進肝細胞增殖的蛋白因子，并將其命名為HPPCn(hepatopoietin Cn，HPPCn)。序列分析顯示HPPCn是LANP家族的成員之一。本研究的主要目的是進行HPPCn的生產制備并初步探討純化產物HPPCn在缺血性腦損傷中的作用與機制，從而確定HPPCn在缺血性腦損傷中是否具有防治作用。
　　 首先，為解決包涵體對分離純化工作帶來的不便，本實驗嘗試使用Rosetta菌種，通過制備感受態(tài)，

2、轉入pET-24a-d(+)/HPPCn質粒生產目的蛋白，使重組蛋白分泌表達，避免形成包涵體。
　　 其次，利用工程菌在高密度發(fā)酵條件下誘導表達重組蛋白，獲得的菌體總蛋白3000g，根據(jù)HPPCn的分子量、等電點等特性，采用兩步陰離子交換層析法純化蛋白，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，HPLC分析其純度，Western blot法分析其是否為目的蛋白。結果，采用兩步陰離子交換層析純化的蛋白純度達94％，純化總得率為8.5％，蛋白總量和

3、純度均達體內外活性研究的要求。
　　 最后，利用SD大鼠2-VO全腦缺血模型和氯化鈷損傷模型檢測HPPCn在體內體外的生物活性。根據(jù)SD大鼠2-VO全腦缺血模型分為24h組，1h組和對照組，構建模型，取腦，組織RNA的提取，RT-PCR結果表明缺血早期，腦組織HPPCn表達顯著提高，提示HPPCn在神經系統(tǒng)對抗缺血損傷過程中發(fā)揮作用。根據(jù)氯化鈷損傷模型采用200ug/l氯化鈷濃度構建損傷模型，給予三個濃度0ug/ml、0.2ug