CYP3A4及其四種突變體與POR和Cyt b-,5-三重共表達(dá)體系的建立與活性比較.pdf

1、本課題應(yīng)用桿狀病毒-昆蟲表達(dá)系統(tǒng)異源表達(dá)了人CYP3A4野生型蛋白質(zhì)及CYP3A4.3、CYP3A4.4、CYP3A4.5和CYP3A4.18四個(gè)功能變化的突變體蛋白質(zhì)，并比較了野生型蛋白質(zhì)與突變體之間的代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)，同時(shí)還研究了各重組蛋白質(zhì)的非典型動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。CYP3A4突變體蛋白質(zhì)的成功表達(dá)為CYP3A4突變體體外藥物代謝研究提供了單一的酶源。
　　 目的:表達(dá)CYP3A4野生型蛋白質(zhì)及CYP3A4.3、CYP3A4.4、

2、CYP3A4.5和CYP3A4.18四個(gè)突變體蛋白質(zhì)，利用CYP3A4經(jīng)典底物睪酮比較代謝動(dòng)力學(xué)差異，同時(shí)為藥物I相代謝的體外研究提供單一性的酶源。
　　 方法:以CYP3A4野生型序列通過定點(diǎn)突變獲得四個(gè)突變體的cDNA序列。將這些基因分別連接至pGEM-T載體進(jìn)行測序，選取正確序列的CYP3A4四個(gè)突變型基因連接至pFastBac質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒pFastBac-3A4s轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過轉(zhuǎn)座作用

3、，產(chǎn)生重組粘粒(Bacmid-CYP3A4)。將各重組粘粒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞后，即產(chǎn)生重組桿狀病毒。CYP3A4介導(dǎo)的藥物代謝需要細(xì)胞色素氧化還原酶(POR)和細(xì)胞色素bs的參與，由于昆蟲細(xì)胞Sf9本身的POR和bs表達(dá)水平比較低，并且不含有血紅素，因此在CYP表達(dá)的時(shí)候，需要添加POR，bs和氯高鐵血紅素。將構(gòu)建好的CYP3A4病毒，與本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建好的P450氧化還原酶(POR)、CYP bs病毒一起加入Sf9細(xì)胞中共表達(dá)這三種蛋白質(zhì)以

4、獲得有代謝活性的重組酶。通過測定共表達(dá)方法中三種病毒間不同的比例、不同的細(xì)胞感染復(fù)數(shù)值，以及不同的表達(dá)時(shí)間等條件下的活性，選取最佳表達(dá)條件。采用RT-PCR在mRNA水平上驗(yàn)證CYP3A4s基因在表達(dá)；采用western-blot檢驗(yàn)細(xì)胞是否在蛋白質(zhì)水平上表達(dá)了各重組人CYP3A4蛋白質(zhì)，以及表達(dá)的水平。以睪酮和7.甲氧基-4-三氟甲基香豆素作為底物，分別檢測重組酶的活性，最后利用睪酮比較CYP3A4野生型與突變體之間的代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，

5、采用米氏方程模型比較了野生型和突變體蛋白質(zhì)的代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)，利用Hill等式模型擬合分析了野生型和突變體蛋白質(zhì)的非典型動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。
　　 結(jié)果:對構(gòu)建各CYP3A4各重組病毒的每個(gè)步驟進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了含有正確基因序列的各重組CYP3A4病毒。將各重組CYP3A4病毒分別感染Sf9細(xì)胞，通過RT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了目的基因在mRNA水平上的表達(dá)；利用western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了目的蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。最

6、后以CYP3A4經(jīng)典睪酮為底物，對重組酶的代謝活性進(jìn)行了檢測，CYP3A4野生型及CYP3A4.3、CYP3A4.4、CYP3A4.5和CYP3A4.18突變體重組酶對睪酮的代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km分別為136、147、192、430和110μmol·L-1，Vmax分別為64、120、187、73和212pmol·min-1·g-1蛋白質(zhì)。應(yīng)用Hill方程擬合代謝實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到S50為130、150、170、180和130μmol·L-1，V

7、max分別為63、122、180、44和228 pmol·min-1·g-1蛋白質(zhì)，n值為1.03、0.98、1.10、1.38和0.93。
　　 結(jié)論:與野生型CYP3A4比較，CYP3A4.5活性明顯低于野生型，而CYP3A4.3，CYP3 A4.4和CYP3A4.18活性高于野生型，尤其以CYP3A4.18的活性最高。非典型動(dòng)力學(xué)模型擬合的結(jié)果發(fā)現(xiàn)CYP3A4.4和CYP3A4.5可能具有正協(xié)同性質(zhì)，而CYP3A4.18可