人CYP3A4與POR及cyt b5共表達(dá)條件的優(yōu)化以及表達(dá)產(chǎn)物在藥物相互作用研究中的應(yīng)用.pdf

1、人細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450，CYP)是一大類含有血紅素分子的單加氧酶超家族，對外源及內(nèi)源性的物質(zhì)代謝以及環(huán)境致癌物的活化都起著至關(guān)重要的作用。細(xì)胞色素P450中主要負(fù)責(zé)藥物代謝的酶有3個家族：CYP1、CYP2和CYP3，包括了：CYP1A2、CYP2A6、CYP2A13、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4等。在人體內(nèi)眾多的CYP450中，CYP3A4是人肝臟中含量最豐富，也是

2、與藥物代謝最為相關(guān)的一類酶。
　　 CYP3A4代謝了大約50％的臨床藥物，具有廣泛的代謝底物譜，并且底物結(jié)構(gòu)和親和力具有多樣性。睪酮和咪達(dá)唑侖是CYP3A4活性鑒定的首選經(jīng)典底物。CYP3A4催化的典型代謝途徑有C-氧化，如尼古丁(nicotine)；N-氧化，如伏立康唑(voriconazole)；N-脫烷基，如芬太尼(fentanyl)；O-脫烷基，如氟西汀(fluoxetine)；脫氫，如澳哌利多(bromperidol

3、)和氟哌啶醇(haloperidol)；硝基還原，如氯硝西泮(clonazepam)和C-羥化，如特非那定(terfenadine)(GuergerichFP et al.，1999)。
　　 人細(xì)胞色素P450氧化還原酶(cytochrome P4500xidoreductase，POR)是一個錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的重要黃素蛋白(Williams CH et al.，1962；Phillips AH et al.，1962；Pan

4、dey AV et al.，2010；Miller WL et al.，2011)，能通過其FMN與FAD輔基將NADPH上的電子傳遞給CYP450，以實現(xiàn)CYP450對底物的氧化功能(Porter TD etal.，1991；Pandey AV et al.，2010；Porter TD et al.，2011)。
　　 人細(xì)胞色素b5(Cytochrome bs，cyt bs)是細(xì)胞色素b家族一類膜錨定的蛋白。細(xì)胞色素bs攜

5、帶有兩個鐵血紅素基團(tuán)，為其他膜錨定的加氧酶(如某些CYP450)傳遞電子。
　　 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，克隆和異源表達(dá)基因重組人蛋白酶被越來越廣泛的應(yīng)用于科研當(dāng)中。異源表達(dá)系統(tǒng)可以高效、大量地獲得較高活性的重組人藥物代謝酶，從而可以在體外對某一個單一的藥物代謝酶進(jìn)行研究。在實際的研究過程中，人們嘗試比較了多種表達(dá)系統(tǒng)，其中桿狀昆蟲表達(dá)系統(tǒng)不僅表達(dá)量高，而且具有正確的糖基化、磷酸化和組織定位表達(dá)等優(yōu)點，且所表達(dá)的蛋白生物學(xué)特性

6、與天然蛋白相似，可以其建立高預(yù)測能力的代謝模型，對臨床用藥有很大指導(dǎo)意義。
　　 本實驗采用Bac-to-Bac()桿狀病毒昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，共表達(dá)了CYP3A4、POR和cyt bs，并對表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了活性較好的CYP3A4、POR和cyt bs共表達(dá)微粒體。此外，我們將得到的微粒體對不同底物的代謝動力學(xué)進(jìn)行了研究，并進(jìn)一步進(jìn)行了藥物相互作用的研究。
　　 一.人CYP3A4、POR與cyt bs的構(gòu)建及共

7、表達(dá)目前用來表達(dá)藥物代謝酶的表達(dá)系統(tǒng)有許多種，其中主要包括大腸桿菌、酵母、哺乳動物細(xì)胞和Bac-to-Bac()桿狀病毒昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。本實驗采用病毒昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來獲得重組CYP3A4、POR和cyt bs的共表達(dá)產(chǎn)物。
　　 本實驗通過自己設(shè)計引物，從實驗室已有的載體上PCR得到CYP3A4、POR和cyt bs的目的基因。然后，將這些目的基因分別進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物回收后與pFastBacTM1載體相連。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至

8、DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆進(jìn)行PCR、雙酶切鑒定，并經(jīng)測序確證后，分別將重組pFastBacTM1-CYP3A4、pFastBacTM1-POR和pFastBacTM1-cyt bs質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至MAX Efficiency DH10BacTMcompetent Escherichia coli中，在DH10Bac中發(fā)生轉(zhuǎn)座，分別獲得Bacmid-CYP3A4、Bacmid-POR和Bacmid-cyt b5重組粘粒。然后，分別用這些

9、粘粒轉(zhuǎn)染Sf9(Spodopterafrugiperda9)細(xì)胞，即可獲得第一代重組桿狀病毒P1，將P1經(jīng)過擴(kuò)增后依次得到P2、P3，一般P3即可用于蛋白的表達(dá)。
　　 將得到的v-CYP3A4、v-POR和v-cyt bs三種病毒分別按一定的比例(例如v-CYP3A4：v-POR：v-cyt bs=1:1:1)同時加入至一瓶Sf9細(xì)胞中，使其同時感染細(xì)胞發(fā)生共表達(dá)。同時，為了得到更高代謝活性的蛋白，我們又用新的載體pFastB

10、acTMDual構(gòu)建了pFastBacTMDual-POR-CYP3A4重組質(zhì)粒。用上述同樣的方法得到P3的v-POR-CYP3A4后，我們將該病毒與v-cyt bs按1:1的比例加入至Sf9細(xì)胞中進(jìn)行CYP3A4、POR和cyt b5的共表達(dá)。
　　 為了進(jìn)行蛋白的大量表達(dá)，提高目的蛋白的表達(dá)量，我們還對Sf9細(xì)胞的搖瓶培養(yǎng)條件進(jìn)行了摸索。通過反復(fù)實踐，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)恒溫?fù)u床的溫度為27℃，轉(zhuǎn)速為90rpm，80-120ml每25

11、0ml搖瓶中加入細(xì)胞密度為5×105個/ml的細(xì)胞液，并加入0.1%的Pluronic()F-68，細(xì)胞培養(yǎng)72h時，最適合細(xì)胞的生長和目的蛋白的表達(dá)。
　　 二.CYP3A4對不同底物的代謝動力學(xué)研究CYP3A4是人藥物代謝酶中最重要的酶，主要存在于肝臟和小腸中。CYP3A4酶約占人肝臟CYP450總量的30～40%(Paine MJ et al.，2000)，代謝了約38類多于150種的臨床用藥(Miners JO et a

12、l.，1996)，包括抗生素、抗真菌藥、抗抑郁藥、抗組胺藥、鈣拮抗劑、鎮(zhèn)靜催眠藥及激素等(Crespi CL et al.，1997)。因此，針對CYP3A4單一酶的代謝研究在藥物代謝學(xué)以及臨床藥理學(xué)上都占據(jù)著重要的地位。
　　 本實驗通過Bac-to-Bac()表達(dá)系統(tǒng)獲得CYP3A4、POR和cyt b5共表達(dá)產(chǎn)物，制備成微粒體，然后利用這些微粒體分別對睪酮和咪達(dá)唑侖這兩種底物進(jìn)行代謝，經(jīng)過動力學(xué)曲線的擬合，分別得到兩條代謝

13、動力學(xué)曲線以及各代謝動力學(xué)參數(shù)。此外我們還對這兩種代謝底物及產(chǎn)物的方法學(xué)、孵育條件和高效液相色譜(HighPerformance Liquid Chromatography，HPLC)條件進(jìn)行了考察。通過對各底物代謝動力學(xué)的分析，我們得到共表達(dá)微粒體對睪酮和咪達(dá)唑侖這兩種底物代謝時的動力學(xué)參數(shù)分別為：睪酮，Km、Vmax與CLint分別為119.6±13.79μmol/L、0.52±0.026μmol/min/g protein和4.3

14、4 mL/min/g protein；咪達(dá)唑侖，Km、Vmax與CLint分別為6.79±0.56μmol/L、0.11±0.0029μmol/min/g protein和15.56 mL/min/g protein。
　　 本文運(yùn)用在Sf9中共表達(dá)CYP3A4、POR和cytb5得到的微粒體對睪酮和咪達(dá)唑侖這兩種底物的代謝動力學(xué)進(jìn)行了研究，并分別對其方法學(xué)、孵育條件和HPLC條件進(jìn)行了考察。
　　 三.CYP3A4在藥

15、物相互作用研究中的應(yīng)用由于CYP3A4廣泛的代謝底物譜，許多藥物不良反應(yīng)(Adverse Drug Reaction，ADR)是由CYP3A4代謝藥物之間的藥物相互作用(Drug-Drug Interaction，DDI)所引起的(Guengerich FP et al.，1997)。因此異源重組表達(dá)CYP3A4，并研究其底物之間的藥物相互作用可以為臨床上體內(nèi)的藥物相互作用提供可靠的參考(Masimirembwa CM et al.，1

16、999)。
　　 本實驗將上述共表達(dá)得到的微粒體用于考察酮康唑?qū)ΣG酮代謝的影響以及咪達(dá)唑侖與睪酮之間的相互影響。最終，我們得到：隨著濃度的增加，酮康唑?qū)YP3A4代謝睪酮生成6β-羥基睪酮的抑制作用逐漸增強(qiáng)，通過Dixon作圖法我們得到其抑制常數(shù)Ki值為0.0594±0.00586μM。在咪達(dá)唑侖對睪酮代謝影響的實驗中，當(dāng)?shù)孜锊G酮的濃度低于Km時，咪達(dá)唑侖對CYP3A4代謝睪酮生成6β-羥基睪酮具有明顯的抑制作用，并且這種抑制

17、作用隨著底物濃度的降低而增強(qiáng)。而當(dāng)?shù)孜锊G酮的濃度達(dá)到200μM時，只有較高濃度的咪達(dá)唑侖(大于40μM)才對睪酮的代謝具有抑制作用，較低濃度的咪達(dá)唑侖反而對睪酮的代謝具有促進(jìn)作用。而在睪酮對咪達(dá)唑侖代謝影響的實驗中，睪酮對不同濃度咪達(dá)唑侖的代謝都有明顯的抑制作用，并且這種抑制作用隨著底物濃度的降低而增強(qiáng)。
　　 本課題得到的實驗結(jié)果提示，利用Bac-to-Bac()表達(dá)系統(tǒng)共表達(dá)得到的CYP3A4、POR和cyt b5微粒體具有