2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、本論文應(yīng)用分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù),建立人源CYP450s同工酶高表達(dá)體系和核受體介導(dǎo)的CYP3A4和MDR1誘導(dǎo)作用研究體系。再利用同工酶高表達(dá)體系初步探討黃芩素和黃芩苷對(duì)CYP2E1重組酶的抑制作用;通過核受體介導(dǎo)的誘導(dǎo)體系探討綠原酸、人參皂苷Rf、黃芩苷和黃芩素對(duì)CYP3A4和。MDR1的誘導(dǎo)作用及其分子機(jī)制,不僅為體外藥物代謝的研究提供實(shí)用的實(shí)驗(yàn)?zāi)P停矠樯鲜鏊幬锏呐R床應(yīng)用提供有參考價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
   1.人源CY

2、P450s高表達(dá)體系的構(gòu)建及應(yīng)用
   1.1 CYP450氧化還原酶(Cytochrome P450 oxidoreductase,CYPOR)作為主要電子供體對(duì)CYP450同工酶活性的保持具有重要作用。本研究首先應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)擴(kuò)增獲得CYPOR編碼序列基因片段,插入至pET-22b(+)原核表達(dá)載體后構(gòu)建p

3、ET-22b(+)-CYPOR重組表達(dá)載體。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,成功獲得CYPOR重組蛋白。經(jīng)測(cè)定,重組CYPOR蛋白酶活性為1309.64nmol/mg·min,可作為工具酶用于后續(xù)研究。
   1.2桿狀病毒.昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(Bac-to-Bac)具有安全性好、表達(dá)水平高,可進(jìn)行翻譯后加工的特點(diǎn),是一種非常理想的真核表達(dá)系統(tǒng)。本研究利用Bac-to-Bac系統(tǒng)建立了人源CYP450s高表達(dá)體

4、系,獲得了CYP2E1、CYP2D6和CYP3A4等3種重組同工酶。應(yīng)用特異性底物測(cè)定表達(dá)產(chǎn)物酶活性,結(jié)果表明,CYP2E1重組酶活性最高;多種因素可對(duì)表達(dá)產(chǎn)物酶活性產(chǎn)生影響,條件優(yōu)化是獲得CYP2E1重組酶最佳表達(dá)量和最高酶活性的重要環(huán)節(jié)。具體而言,當(dāng)MOI值為0.1時(shí),CYP2E1重組酶活性最高,之后隨著MOI值的增大而逐漸減?。恢亟M病毒感染細(xì)胞72h時(shí)獲得的CYP2E1酶活性顯著高于48h、96h和120h; CYPOR和細(xì)胞色素

5、b5(Cytochrome b5,CYb5)的濃度對(duì)重組酶活性也有很大影響,適量添加對(duì)酶的催化反應(yīng)有利。CYP2D6和CYP3A4重組酶已經(jīng)進(jìn)行了MOI值、病毒感染時(shí)間和CYPOR、CYb5濃度等條件的優(yōu)化,但更為適合的條件仍有待進(jìn)一步探索。
   1.3應(yīng)用已獲得較高酶活性的CYP2E1重組酶初步研究了黃芩苷和黃芩素對(duì)CYP450同工酶的抑制作用。結(jié)果表明,黃芩苷的IC50為5.702μM,而黃芩素的IC50>50μM。提示黃

6、芩苷對(duì)CYP2E1具有較強(qiáng)的抑制作用,而黃芩素的抑制作用較弱。
   2.核受體介導(dǎo)的人源CYP3A4及MDR1誘導(dǎo)作用研究體系的構(gòu)建和應(yīng)用
   2.1本研究首先應(yīng)用RT-PCR方法獲得人源CYP3A4的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和視黃醛X受體(retinoid X receptorα,RXRα)基因片段,分別插入至pGL4.10和pCDNA3.1(-)表達(dá)載體中成功構(gòu)建pGL4.10-CYP3A4啟動(dòng)子報(bào)告基因表達(dá)載體和pCDN

7、A3.1(-)-RXRα真核表達(dá)載體。
   2.2 mRNA水平測(cè)定是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究的重要方面。本研究應(yīng)用real time PCR方法考察了黃芩苷、黃芩素、綠原酸和人參皂苷Rf對(duì)CYP3A4和MDR1 mRNA水平的影響。結(jié)果顯示,黃芩苷、黃芩素、綠原酸和人參皂苷Rf對(duì)CYP3A4和MDR1轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)生不同程度的誘導(dǎo)作用。黃芩素的誘導(dǎo)作用最強(qiáng);綠原酸和人參皂苷Rf僅對(duì)CYP3A4有誘導(dǎo)作用;黃芩苷對(duì)兩者則皆無(wú)明顯影響。黃芩

8、素、綠原酸和人參皂苷Rf還對(duì)CYP3A4 mRNA水平的影響具有一定的濃度依賴性,其濃度分別為20、0.1和10μM時(shí)對(duì)CYP3A4的誘導(dǎo)作用最強(qiáng),為陰性對(duì)照的3.4倍、2.5倍和2倍。外,黃芩素、綠原酸和人參皂苷Rf對(duì)CYP3A4的蛋白表達(dá)和酶活性水平亦表現(xiàn)出一定的誘導(dǎo)作用。
   2.3 PXR和CAR是調(diào)控CYP3A4和MDR1基因轉(zhuǎn)錄水平的主要核受體。本研究應(yīng)用報(bào)告基因檢測(cè)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)建立了核受體介導(dǎo)的人源CYP3A4

9、和MDR1誘導(dǎo)作用研究體系。并用PXR和CAR受體的典型配體-利福平和CITCO對(duì)該體系進(jìn)行了證實(shí)。研究結(jié)果表明,利福平能夠顯著增強(qiáng)PXR受體介導(dǎo)的CYP3A4和MDR1基因轉(zhuǎn)錄;CITCO通過活化CAR受體途徑上調(diào)了CYP3A4和MDR1基因轉(zhuǎn)錄水平。提示該研究體系成功建立,可用于藥物對(duì)CYP3A4和MDR1誘導(dǎo)作用的研究。應(yīng)用該體系,本研究考察了黃芩苷、黃芩素、綠原酸和人參皂苷Rf對(duì)CYP3A4和MDR1的誘導(dǎo)作用機(jī)制。結(jié)果顯示,黃

10、芩素可以顯著增強(qiáng)CAR和PXR受體介導(dǎo)的CYP3A4和MDR1基因轉(zhuǎn)錄水平;綠原酸和人參皂苷Rf能夠上調(diào)CAR受體介導(dǎo)的CYP3A4啟動(dòng)子活性,而PXR受體則較少參與,二者對(duì)MDR1啟動(dòng)子活性無(wú)明顯影響。
   2.4 CYP3A4基因啟動(dòng)子反應(yīng)元件-DR3和ER6以及MDR1基因啟動(dòng)子反應(yīng)元件-DR4(Ⅰ)均能被CAR-RXRα和PXR-RXRα二聚體識(shí)別并發(fā)揮基因表達(dá)調(diào)控作用。針對(duì)DR4(Ⅰ)、DR3和ER6進(jìn)行的EMSA研

11、究可以更為深入的揭示誘導(dǎo)作用及其機(jī)制。研究顯示,黃芩素可以明顯增強(qiáng)CAR/RXRα二聚體與DR3、ER6/DR4(Ⅰ),PXR/RXRα二聚體與DR3的結(jié)合作用,而對(duì)DR4(Ⅰ)和ER6與PXR/RXRα二聚體的結(jié)合能力無(wú)顯著影響。
   2.5大部分常用藥物均經(jīng)CYP3A代謝,包括新型免疫抑制劑他克莫司在內(nèi)的多種藥物亦是CYP3A和P-gp的共同底物;上述研究已經(jīng)證實(shí),黃芩素對(duì)CYP3A和P-gp均有誘導(dǎo)作用,因此當(dāng)黃芩素制劑

12、與上述藥物合用時(shí)應(yīng)考慮到藥物間相互作用發(fā)生的可能性。本研究利用體內(nèi)研究方法對(duì)此進(jìn)行了探討,結(jié)果顯示,黃芩素多次給藥可降低他克莫司血藥濃度,其中峰濃度降低約57%,AUC減小約55%。
   綜上所述,本研究構(gòu)建了人源CYP450s同工酶高表達(dá)體系和核受體介導(dǎo)的CYP3A4和MDR1誘導(dǎo)作用研究體系。利用同工酶高表達(dá)體系獲得的高活性重組CYP2E1同工酶研究證實(shí),黃芩苷對(duì)CYP2E1具有一定的抑制作用,而黃芩素抑制作用較弱。本研究

13、還利用核受體介導(dǎo)的CYP3A4和MDR1誘導(dǎo)作用研究體系考察了黃芩素、綠原酸和人參皂苷Rf對(duì)CYP3A4和MDR1的誘導(dǎo)作用及其機(jī)制。結(jié)果表明,黃芩素可以顯著增強(qiáng)CAR和PXR受體介導(dǎo)的CYP3A4和MDR1基因轉(zhuǎn)錄水平;綠原酸和人參皂苷Rf能夠上調(diào)CAR受體介導(dǎo)的CYP3A4啟動(dòng)子活性,而PXR受體則較少參與,二者對(duì)MDR1啟動(dòng)子活性無(wú)明顯影響。人源化CYP450s同工酶高表達(dá)體系和核受體介導(dǎo)的人源CYP3A4和MDR1誘導(dǎo)作用研究體

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