磷霉素與多黏菌素E對耐碳青霉烯銅綠假單胞菌感染的聯(lián)合效應(yīng)及對多黏菌素E腎毒性的影響.pdf

1、目的:評價磷霉素和多黏菌素E對耐碳青霉烯銅綠假單胞菌(CRPA)體內(nèi)、體外聯(lián)合抗菌效應(yīng)及探討磷霉素對多黏菌素E腎毒性的保護(hù)作用，并初步分析85株臨床分離CRPA的耐藥機(jī)制。
　　方法:
　　(1)通過瓊脂平板稀釋法測定11種抗菌藥物對85株CRPA的最低抑菌濃度(MIC)，采用微量肉湯稀釋法，棋盤法設(shè)計測定磷霉素與多黏菌素E不同藥物濃度組合對85株CRPA的MIC，計算聯(lián)合抑菌指數(shù)(FICI)，判定兩者的聯(lián)合效應(yīng);采用時間—

2、殺菌曲線觀察磷霉素與多黏菌素E單用或聯(lián)用對5株CRPA的抗菌作用，進(jìn)一步判定兩者聯(lián)合效應(yīng)。
　　(2)通過亞抑菌抗菌藥物濃度肉湯傳代法用美羅培南誘導(dǎo)發(fā)光菌株銅綠假單胞菌(PA) Xen5對碳青霉烯類藥物耐藥;建立CRPA腹腔感染小鼠模型，評價磷霉素和高、低劑量多黏菌素E單用及聯(lián)用的治療效果。
　　(3)建立多黏菌素E大鼠腎毒性模型，評價磷霉素對多黏菌素E腎毒性的保護(hù)作用。
　　(4)采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測85株

3、CRPA是否存在VIM、IMP、SPM、NDM-1和GIM五種基因型金屬β內(nèi)酰胺酶(MBL);利用瓊脂平板稀釋法分別測定美羅培南(MEP)、亞胺培南(IMP)有或沒有外排泵抑制劑碳酰氰間氯苯腙(CCCP)時對85株CRPA的MIC值，當(dāng)聯(lián)合CCCP后MIC值較單用MIC降低4倍或以上被認(rèn)為該菌株為外排泵陽性，并利用實(shí)時熒光定量PCR方法檢測4種外排泵基因MexAB-OprM，MexCD-OprJ，mexEF-OprN，mexXY-Opr

4、M中的MexB，MexD，MexF和MexY的表達(dá)情況;利用PCR擴(kuò)增oprD2編碼基因序列，觀察oprD2基因變異情況，初步探討85株CRPA耐藥機(jī)制的分布情況，并采用脈沖場凝膠電泳(PFGE)的方法分析85株CRPA菌株的同源性。
　　結(jié)果:
　　(1)磷霉素與多黏菌素E聯(lián)合應(yīng)用時，91.76％(78/85)菌株多黏菌素E的MIC≤0.5mg/L，明顯高于其單用MIC≤0.5mg/L菌株所占比率(25.88％);85株C

5、RPA的FICI分布為:FICI≤0.5占21.18％，0.5＜FICI＜1占27.06％，F(xiàn)ICI=1占5.88％，1＜FICI≤2占45.88％，未發(fā)現(xiàn)FICI＞2;時間—?dú)⒕€:磷霉素和多黏菌素E在1/2MIC和MIC聯(lián)合時對PA1、PA2、PA3、PA4有協(xié)同殺菌作用，對PA5，僅在MIC聯(lián)合時有協(xié)同殺菌作用，且在聯(lián)用磷霉素后，多黏菌素E單用時的細(xì)菌再生長被抑制。
　　(2) CRPA腹腔感染小鼠，在藥物治療5h內(nèi)，磷霉

6、素，低劑量多黏菌素E單用比兩者聯(lián)合效果差，且低劑量多黏菌素E感染有所加重;多黏菌素E高劑量的抗菌作用優(yōu)于其低劑量，提示多黏菌素E抗菌作用具有濃度依賴性;高劑量多黏菌素E組、磷霉素和高劑量多黏菌素E聯(lián)合組小鼠生物發(fā)光強(qiáng)度(CPS)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但根據(jù)臟器實(shí)際載菌量比較，后者（聯(lián)合組）肝臟、腎臟、肺臟以及血液系統(tǒng)實(shí)際載菌量少于前者（多黏菌素高劑量單用）;各臟器組織病變主要在肝臟、肺臟、腎臟，對照組病變較重，高劑量多黏菌素E組，磷霉素分別

7、與高、低劑量多黏菌素E聯(lián)合組病變程度有所減輕。
　　(3)成功建立多黏菌素E大鼠腎損害模型，多黏菌素E組大鼠血肌酐和尿NAG酶水平增高，和對照組、聯(lián)合用藥組（磷霉素和多黏菌素聯(lián)合）比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義;磷霉素和多黏菌素E聯(lián)合組與對照組比較血肌酐和尿NAG酶水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義;腎臟病理切片半定量評分比較結(jié)果顯示多黏菌素E組腎臟損害明顯，與其他各組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而磷霉素和多黏菌素E聯(lián)合組基本正常。
　　(4)85株C

8、RPA耐藥機(jī)制的研究顯示:85株CRPA不產(chǎn)VIM、IMP、SPM、NDM-1和GIM五種基因型MBLs;外排泵抑制劑CCCP可以使9株CRPA亞胺培南或美羅培南MIC值降低4倍或以上，占10.59％，其中MexAB高表達(dá)有5株，MexCD高表達(dá)有5株，MexEF高表達(dá)有1株，MexXY高表達(dá)有7株;69株(69/85，81.18％) CRPA出現(xiàn)oprD2基因小片段或大片段缺失等變異;經(jīng)PFGE分析發(fā)現(xiàn)，85株CRPA被分為32個PF

9、GE指紋型，在三家醫(yī)院間PFGE指紋型中菌株相似≥90％以上所占比率較少，說明流行趨勢以散發(fā)為主，未有爆發(fā)流行。
　　結(jié)論:
　　(1)磷霉素與多黏菌素E聯(lián)用對CRPA以協(xié)同和部分協(xié)同作用為主，未發(fā)現(xiàn)拮抗作用;兩者聯(lián)用后可以明顯降低CRPA多黏菌素E的MIC值。
　　(2)磷霉素和多黏菌素E高、低兩個劑量聯(lián)用對小鼠腹腔CRPA感染有很好的協(xié)同抗菌作用，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　(3)磷霉素可減輕多黏菌素E所致