Necrostatin-1對創(chuàng)傷失血性休克大鼠肝臟保護(hù)作用的研究.pdf

1、目的:探討Necrostatin-1（程序性壞死特異性抑制劑-1）對創(chuàng)傷失血性休克大鼠肝臟的保護(hù)作用。
　　方法:實(shí)驗(yàn)對象為清潔健康雄性SD大鼠，體重250～300 g。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為兩部分:第一部分為創(chuàng)傷失血性休克大鼠模型的建立。將40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=20)、模型組(n=20)，模型組采用左下肢股骨、脛骨骨折及腹部軟組織損傷并失血的方法制備大鼠創(chuàng)傷失血性休克模型;假手術(shù)組僅麻醉和分離、結(jié)扎血管，不進(jìn)行創(chuàng)傷失血和

2、再灌注。記錄各組大鼠24 h死亡率;采用全自動生化儀檢測血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)的變化;蘇木素-伊紅(HE)染色觀察肝組織病理學(xué)改變。第二部分為應(yīng)用程序性壞死特異性抑制劑-1(Nec-1)，觀察此抑制劑對創(chuàng)傷失血性休克大鼠肝臟的影響。將72只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=24)、DMSO對照組(n=24)、Nec-1組(n=24)，Nec-1組于再灌注前5 min經(jīng)股靜脈給予1 mg/kg Nec-1(1

3、 mg Nec-1溶于0.04 mL DMSO中，加生理鹽水至0.5 mL); DMSO對照組給予等體積溶劑。于再灌注后2h、4h、8h收集血清和肝組織，部分肝組織用石蠟包埋制作病理切片。采用全自動生化儀檢測ALT、AST的變化;采用蘇木素-伊紅（HE）染色觀察肝組織病理學(xué)改變;采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）的變化;采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測肝組織TN

4、F-α mRNA和IL-1β mRNA的表達(dá);采用蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)(Western blot)檢測肝組織受體相互作用蛋白酶1/3(RIP1和RIP3)的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　第一部分:建立創(chuàng)傷失血性休克大鼠模型，24 h假手術(shù)組死亡率為0，而模型組死亡率為30.00％(P＜0.01)。模型組血清ALT、AST濃度較假手術(shù)組明顯升高(P＜0.01)。假手術(shù)組大鼠肝臟HE染色顯示肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，無明顯炎性細(xì)胞浸潤，未見變性、

5、壞死;模型組大鼠肝臟HE染色顯示肝竇擴(kuò)張、淤血，大量炎性細(xì)胞浸潤，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，部分肝細(xì)胞變性、壞死。
　　第二部分:(1)與假手術(shù)組相比較，DMSO組血清ALT、AST的濃度2h即開始升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），8h達(dá)到高峰（P＜0.01）。而應(yīng)用Nec-1后，2h血清ALT、AST的濃度雖較DMSO組低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而4h、8h血清ALT、AST的濃度均較DMSO組顯著降低（P＜0.01）。(2)HE染色

6、光鏡下觀察假手術(shù)組各時間點(diǎn)肝組織結(jié)構(gòu)未見明顯異常。DMSO組:2h肝竇擴(kuò)張、淤血，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，少量炎性細(xì)胞浸潤，4 h～8 h上述改變更加明顯，部分肝細(xì)胞變性、壞死。而應(yīng)用Nec-1后，各時間點(diǎn)肝損傷程度明顯減輕。(3)與假手術(shù)組相比較，DMSO組血清TNF-α、IL-1β的濃度2h即開始升高，8h達(dá)到高峰(P＜0.01)。而Nec-1組TNF-α、IL-1β的濃度各時間點(diǎn)均較DMSO組明顯降低(P＜0.05)。(4)RT-PCR檢

7、測發(fā)現(xiàn)，DMSO組肝組織TNF-αmRNA、IL-1β mRNA的表達(dá)2h開始升高，8h達(dá)到高峰(P＜0.01)，而應(yīng)用Nec-1后各時間點(diǎn)肝組織TNF-α mRNA、IL-1β mRNA的表達(dá)水平顯著低于DMSO組(P＜0.05)。(5)Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，DMSO組肝組織RIP1和RIP3的表達(dá)在2h即明顯增加，8h達(dá)到高峰（P＜0.01）。但Nec-1組與DMSO組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　

8、結(jié)論:
　　1、本次實(shí)驗(yàn)證實(shí)創(chuàng)傷失血性休克時大鼠出現(xiàn)急性肝損害，可發(fā)現(xiàn)肝功能異常，肝組織及血清炎性因子的表達(dá)升高，肝臟病理學(xué)改變明顯;肝組織內(nèi)RIP1和RIP3的表達(dá)升高，說明程序性壞死在創(chuàng)傷失血性休克大鼠肝損傷機(jī)制中發(fā)揮重要作用;
　　2、應(yīng)用Nec-1后，可改善肝功能，減輕肝臟病理學(xué)變化，降低血清及肝組織炎性因子表達(dá)，說明Nec-1對創(chuàng)傷失血性休克大鼠肝臟具有保護(hù)作用;但并不影響肝組織內(nèi)RIP1及RIP3的表達(dá)，其具體機(jī)