超聲消融促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染治療廣泛性動(dòng)脈閉塞的初步探討.pdf

1、動(dòng)脈硬化閉塞癥越來(lái)越成為威脅人民健康安全的一類(lèi)常見(jiàn)病。目前的各種治療方法可以改善部分動(dòng)脈硬化閉塞癥患者的生存率及生活質(zhì)量，但是仍有一定的局限性。且仍有部分患者存在的問(wèn)題在目前的治療手段下未能得到根本解決。 基因治療有可能成為人類(lèi)最終征服許多難治性疾病的一種新的治療手段，已有眾多將基因治療用于動(dòng)脈硬化閉塞癥的報(bào)道。然而，基因治療要廣泛地應(yīng)用于臨床尚存在許多難題，如何將目的基因安全、高效、靶向性地導(dǎo)入人體內(nèi)特定器官、組織，并在靶細(xì)胞

2、內(nèi)表達(dá)是目前有待解決的難題之一。 血管腔內(nèi)超聲消融術(shù)已經(jīng)廣泛運(yùn)用于臨床，并被證實(shí)在部分動(dòng)脈硬化閉塞癥中具有較好的療效。超聲及超聲聯(lián)合造影劑可促進(jìn)體內(nèi)外細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染和表達(dá)。眾多研究結(jié)果表明其在促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染的同時(shí)，對(duì)組織細(xì)胞的損傷是可逆性的，不存在明顯的毒性，具有安全、較高效率、靶向性、可控性等優(yōu)點(diǎn)。如果能夠?qū)⒀芮粌?nèi)超聲消融及超聲介導(dǎo)的基因治療結(jié)合起來(lái)，可能會(huì)成為一種新的治療動(dòng)脈硬化閉塞癥的方法。 本實(shí)驗(yàn)探討了超聲消融聯(lián)

3、合造影劑介導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human UmbilicalVein Endotheiial Cell，HUVEC)的基因轉(zhuǎn)染。 方法： 1．通過(guò)胰酶消化法原代培養(yǎng)HUVEC，利用HUVEC與混雜細(xì)胞的不同生長(zhǎng)特點(diǎn)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行純化，并通過(guò)CD31、FVⅢ相關(guān)抗原的免疫組化對(duì)培養(yǎng)出的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。 2．帶有編碼目的蛋白綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因片段的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、細(xì)菌的擴(kuò)增、目

4、標(biāo)質(zhì)粒的提取獲得純度及產(chǎn)量較高的目標(biāo)質(zhì)粒。 3．超聲消融聯(lián)合造影劑介導(dǎo)pEGFP-C3(enhanced green fluorescent protein)轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞和HUVEC，并檢測(cè)轉(zhuǎn)染率及細(xì)胞活性。 結(jié)果： 1．通過(guò)胰酶消化法獲得了穩(wěn)定生長(zhǎng)的HUVEC，4天后細(xì)胞迅速生長(zhǎng)，集落增大，達(dá)50-60﹪，融合時(shí)細(xì)胞鑲嵌排列呈“鋪路石”樣；6天后70-80﹪融合。同時(shí)免疫組化鑒定表明獲得的細(xì)胞CD31及

5、FVⅢ相關(guān)抗原的陽(yáng)性率達(dá)到92﹪以上。 2．在超聲消融儀作用下，HUVEC的轉(zhuǎn)染率較脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染率明顯降低(p<0.05)，但是較無(wú)超聲作用組明顯提高(p<0.05)，而且聯(lián)合超聲造影劑后，其轉(zhuǎn)染率又明顯較單純超聲組提高(p<0.05)。單純?cè)煊皠┎⑽茨艽龠M(jìn)基因轉(zhuǎn)染。而照射時(shí)間(1、10分鐘)的不同也未對(duì)轉(zhuǎn)染率產(chǎn)生明顯的影響。 3．噻唑蘭(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試驗(yàn)的檢測(cè)表

6、明，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后HUVEC的MTT檢測(cè)值與未處理組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。而單純超聲消融作用1分鐘組與未處理組相比則未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。單純超聲消融作用10分鐘及超聲消融聯(lián)合造影劑組與未處理組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是其細(xì)胞活性率仍可達(dá)到90﹪。這可以間接反映不同轉(zhuǎn)染條件對(duì)細(xì)胞活性的影響。 結(jié)論： 1．通過(guò)胰酶消化法培養(yǎng)出HUVEC細(xì)胞，并利用細(xì)胞的不同生長(zhǎng)特點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞純化的方法所得到的細(xì)胞純度較高，經(jīng)免疫組化檢測(cè)證實(shí)其為