PCOS與SLC30A8基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)及雌激素對(duì)B細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、第一部分 多囊卵巢綜合征(PCOS)與SLC30A8基因多態(tài)性位點(diǎn)rs13266634的關(guān)聯(lián)研究 目的：本研究通過(guò)分析比較rs13266634多態(tài)位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率在PCOS病例組與對(duì)照組中分布的差異，比較不同基因型的PCOS病人的內(nèi)分泌及代謝特征表型的差別，研究單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)rsS13266634的不同基因型與PCOS不同臨床表型的相關(guān)性，探討SLC30A8基因在PCOS的發(fā)病及病理生理的變化過(guò)程中的相關(guān)作用，從而

2、驗(yàn)證我們的假設(shè)是否正確。 研究方法： 研究對(duì)象：本研究依據(jù)2003年鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)選擇PCOS患者894例，并選擇622名健康的非糖尿病女性作為對(duì)照。分別測(cè)定PCOS患者的激素、生化指標(biāo)、OGTT，測(cè)量身高、體重、腰圍和臀圍，計(jì)算體重指數(shù)、腰臀比例及HOMA-IR指數(shù)。自肘靜脈抽取外周血，抗凝處理后，提取全血基因組DNA。 基因分型：本研究采用單管等位基因特異性PCR結(jié)合熒光溶解曲線(xiàn)分析的方法進(jìn)行基因分型。根據(jù)方法原

3、理設(shè)計(jì)一對(duì)等位基因特異性上游引物并共用一個(gè)相同的下游引物。PCR反應(yīng)結(jié)束后立即進(jìn)行熒光溶解曲線(xiàn)分析，根據(jù)曲線(xiàn)類(lèi)型的不同進(jìn)行基因分型。PCR反應(yīng)及熒光溶解曲線(xiàn)分析在ABI7500實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)儀上進(jìn)行。基因分型完成后，將所有被分型的標(biāo)本中的2％進(jìn)行測(cè)序，以確定該基因分型方法的準(zhǔn)確性。 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：計(jì)算病例組與對(duì)照組中rs13266634多態(tài)位點(diǎn)各基因型的頻率及等位基因頻率，Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)使用X2檢

4、驗(yàn)來(lái)計(jì)算，病例組與對(duì)照組之間基因型頻率與等位基因頻率的比較采用X2檢驗(yàn)的方法。PCOS組中患者的內(nèi)分泌及代謝特征表型與基因型的關(guān)聯(lián)性分析采用協(xié)方差分析的方法，并將BMI作為協(xié)變量引入。 結(jié)果： 1、在PCOS病例組和對(duì)照組中，單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)rs13266634的基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。 2、在PCOS病例組與對(duì)照組中，rs13266634多態(tài)位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率的分布沒(méi)

5、有顯著差異。 3、在PCOS病例組中，rs13266634多態(tài)位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率在胰島素抵抗組和非胰島素抵抗組患者中的分布沒(méi)有顯著差異。 4、在PCOS病例組中，rs13266634多態(tài)位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率在肥胖組和非肥胖組患者中的分布沒(méi)有顯著差異。 5、在PCOS病例組中，PCOS患者的各種內(nèi)分泌及代謝特征表型與rs13266634多態(tài)位點(diǎn)的基因型分布之間沒(méi)有相關(guān)性。 結(jié)論：SLC

6、30A8基因中的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)rs13266634不是PCOS的疾病相關(guān)基因位點(diǎn)，未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的基因型分布與PCOS患者的內(nèi)分泌及代謝表型特征表型之間存在相關(guān)性。 第二部分雌激素對(duì)B細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用 研究背景：系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一種累及多系統(tǒng)、多臟器，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，病程遷延反復(fù)的自身免疫性結(jié)締組織病，由于患者體內(nèi)有大量致病性自身抗體和免疫復(fù)合物，可以造成組織損傷，臨床上會(huì)出現(xiàn)各系統(tǒng)和臟器損害的癥狀。患者的自身抗原主

7、要是細(xì)胞核內(nèi)的不溶性和可溶性成分、細(xì)胞膜成分、細(xì)胞內(nèi)其他成分等?；颊唧w內(nèi)的自身抗體主要有抗核抗體、抗雙鏈DNA抗體、抗單鏈DNA抗體、抗Sm抗體、抗RNP抗體、抗SSA抗體、抗SSB抗體、抗rRNP抗體、抗磷脂抗體等。有色人種比白種人發(fā)病率高，我國(guó)的患病率約為70/10萬(wàn)。本病女性患者約占90％，常為育齡期婦女，男女患病比為1：7～1：10。 SLE的病因至今尚未被明確闡明，可能與遺傳、環(huán)境、性激素等因素有關(guān)。SLE的發(fā)病機(jī)制

8、中有許多因素的參與，至今的研究認(rèn)為，SLE是在由遺傳因素導(dǎo)致的遺傳易感性的基礎(chǔ)上，在病毒感染或體內(nèi)激素環(huán)境改變等促發(fā)因素的作用下，機(jī)體的免疫系統(tǒng)發(fā)生功能紊亂，導(dǎo)致自身耐受喪失而引起的自身免疫性疾病。研究證明，多種免疫系統(tǒng)功能異常都在SLE的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，如，T、B細(xì)胞的過(guò)度活化，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等抑制性免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞功能減退，干擾素-α、IFN-γ、白細(xì)胞介素-6、IL-10等細(xì)胞因子分泌的異常，細(xì)胞凋亡異常，免

9、疫復(fù)合物清除能力下降等。 在眾多機(jī)制中，患者體內(nèi)B細(xì)胞過(guò)度活化，打破自身耐受，識(shí)別多種自身抗原，產(chǎn)生自身抗體，以及T、B細(xì)胞間相互作用的異常是SLE發(fā)病的核心事件。成熟的自身反應(yīng)性B細(xì)胞產(chǎn)生的自身抗體以及循環(huán)中的免疫復(fù)合物可以直接造成機(jī)體組織器官的損傷，如皮膚和腎臟的損傷。B細(xì)胞還可以產(chǎn)生如腫瘤壞死因子、IL-4、IL-10等促炎細(xì)胞因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。B細(xì)胞還可以作為抗原提呈細(xì)胞提呈抗原，表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類(lèi)分子和CD

10、80、CD86分子等，從而影響其他免疫細(xì)胞的功能。B細(xì)胞功能異?？梢元?dú)立于其他危險(xiǎn)因素誘發(fā)狼瘡樣癥狀，B細(xì)胞這一經(jīng)典的免疫效應(yīng)細(xì)胞已經(jīng)成為SLE治療的潛在靶點(diǎn)。 SLE具有明顯的女性?xún)A向，育齡期男女患病比為1：9，而在絕經(jīng)期男女之比僅為1：3，女性的非性腺活動(dòng)期，SLE的發(fā)病率顯著減少。這種傾向可能與女性激素的作用有關(guān)，在眾多的女性激素中，雌激素的作用最為重要，雌激素是SLE發(fā)病的危險(xiǎn)因素之一。 雌激素具有免疫調(diào)節(jié)作用

11、。一般認(rèn)為，生理水平的雌激素具有免疫活化作用，而高于生理水平的雌激素則具有免疫抑制作用。在中樞免疫器官，雌激素可以調(diào)節(jié)胸腺的發(fā)育和骨髓中各種免疫細(xì)胞的體細(xì)胞的發(fā)育。在外周免疫器官，雌激素可以調(diào)節(jié)多種成熟免疫細(xì)胞如T、B細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、粒細(xì)胞等的功能，可以抑制Th-1型細(xì)胞因子的分泌并促進(jìn)Th-2型細(xì)胞因子的分泌?？偟膩?lái)說(shuō)，雌激素的免疫調(diào)節(jié)作用是傾向于抑制細(xì)胞免疫而促進(jìn)體液免疫。 雌激素具有的免疫調(diào)節(jié)

12、能力，特別是對(duì)B細(xì)胞功能的影響很可能是SLE發(fā)病的女性?xún)A向特征的發(fā)生機(jī)制之一。目前的研究主要集中在雌激素對(duì)B細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的自身耐受形成的干擾作用，而在雌激素對(duì)外周成熟B細(xì)胞的功能的影響方面，目前尚未有全面的研究。在本研究中，我們著眼于雌激素對(duì)外周成熟B細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用。 目的：通過(guò)研究雌激素對(duì)雌性BALB/c小鼠脾臟B細(xì)胞的增殖、活化、凋亡、分化及抗體合成功能的影響，全面觀(guān)察雌激素對(duì)外周成熟B細(xì)胞功能的潛在調(diào)節(jié)作用，從而探討

13、雌激素在SLE的發(fā)病和病情進(jìn)展中可能發(fā)揮的作用。 研究方法：在無(wú)菌條件下分離雌性BALB/c小鼠的脾細(xì)胞，在無(wú)酚紅、含10％炭吸附處理的胎牛血清的液體RPMI1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并根據(jù)需要與不同濃度的不含內(nèi)毒素的、細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)別的17β-雌二醇共培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間依據(jù)研究目的的不同而不同。小鼠脾細(xì)胞總IgG型抗體的合成用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法檢測(cè)。小鼠脾臟B細(xì)胞的凋亡、活化及分化功能使用雙色熒光染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，B細(xì)胞的增殖采用

14、活細(xì)胞熒光染料染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。 結(jié)果： 1、17β-雌二醇可使體外培養(yǎng)的小鼠脾細(xì)胞中的B220+/CD80+細(xì)胞減少，且可使B220+細(xì)胞表面CD80分子的表達(dá)密度降低，但17β-雌二醇對(duì)B220+細(xì)胞上CD86分子的表達(dá)沒(méi)有影響。 2、17β-雌二醇可使體外培養(yǎng)的血清缺乏誘導(dǎo)的小鼠脾B220+細(xì)胞的凋亡減少。 3、17β-雌二醇可以使體外培養(yǎng)的小鼠脾細(xì)胞總IgG型抗體的合成增加。 4、17