雌激素受體基因多態(tài)性與發(fā)育性髖關(guān)節(jié)脫位關(guān)系的研究.pdf

1、目的： 發(fā)育性髖脫位(developmentaldislocationofthehip，DDH)是小兒骨科最常見的四肢畸形之一，地區(qū)與種族不同其發(fā)病率有很大差異，一般白種人發(fā)病率高，黑種人低，而黃種人介于兩者之間。高發(fā)區(qū)如美國、意大利其發(fā)病率為9～12‰，我國報道為1.10～3.80‰不等，女性多于男性，男女之比約為1∶4.75，單側(cè)多見，且左側(cè)多于右側(cè)。 彭明惺等通過家系調(diào)查和雙生子研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)育性髖脫位一級親屬患病率

2、明顯高于一般人群，表明本病為多基因遺傳病，與遺傳和環(huán)境因素密切相關(guān)。早在80年代，國內(nèi)外都曾有組織相容性抗原HLA與先天性懿脫位相關(guān)的報道，為發(fā)育性髖脫位的遺傳背景提供了有力的佐證，目前，多數(shù)資料支持遺傳決定韌帶松弛是造成DDH的重要因素。已有許多學(xué)者[2-4]的動物實(shí)驗(yàn)表明大量雌激素可誘發(fā)產(chǎn)生韌帶松弛、髖關(guān)節(jié)不穩(wěn)定、股骨頭變小從而導(dǎo)致DDH。雌激素受體作為一種調(diào)節(jié)蛋白，通過調(diào)控與代謝有關(guān)的細(xì)胞因子的表達(dá)，對組織細(xì)胞生長增殖起重要作用。

3、近幾年來，在骨關(guān)節(jié)的研究中有不少ER方面的報道，特別是雌激素受體基因多態(tài)性的研究甚多，證明雌激素受體在骨關(guān)節(jié)疾患發(fā)病機(jī)制中起重要作用，Liu[5]的動物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)雌激素水平能影響膠原的合成和纖維細(xì)胞的增生。國內(nèi)外尚無有關(guān)發(fā)育性髖脫位與雌激素受體(estrogenreceptor，ER)基因的相關(guān)報道，為了探討DDH和ER之間的關(guān)系，我們通過對DDH患兒血中ER多態(tài)性分析以及正常兒童血中ER多態(tài)性分析對比，進(jìn)行相關(guān)研究。進(jìn)一步探討DDH

4、的病因和和發(fā)病機(jī)理，為預(yù)防和臨床提供新的依據(jù)。 方法： 1.標(biāo)本收集：DDH組，共收集2003年2月～2004年2月于山東大學(xué)齊魯醫(yī)院住院治療的發(fā)育性髖關(guān)節(jié)脫位患者48例，經(jīng)X片、臨床及手術(shù)確診，年齡在2月～14歲之間，其中男性10例，平均年齡2.9歲，女性38例，平均年齡5.2歲，其中包括左側(cè)患兒22例、右側(cè)患兒12例及雙側(cè)患兒14例；對照組48例，取源于齊魯醫(yī)院門診查體患兒(其中不包含先天性骨骼肌肉及泌尿生殖器畸形)

5、，年齡在2月～13歲之間，其中男性10例，平均年齡3.2歲，女性38例，平均年齡4.2歲。所有患者、對照者均未服用激素類藥物。 2.基因組DNA提?。喝⊥庵莒o脈血2ml，EDTA抗凝，提取白細(xì)胞。用柱式基因組DNA抽提盒(EZ-10SpinColumnBloodGenomicDNAMiniprepsKit)按說明提取DNA。提取的DNA-20℃保存。 3.引物的設(shè)計與合成：引物設(shè)計參照文獻(xiàn)。由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司

6、合成。 引物序列：上游：5'-CTGCCACCCTATCTGTATCTTTTCCTATTCTCC-3'；下游：5'-TCTTTCTCTGCCACCCTGGCGTCGATTATCTGA-3'。 4.PCR擴(kuò)增：反應(yīng)總體積為50ul，預(yù)變性條件94℃5min；循環(huán)條件為94℃變性30s，61℃退火40s，72℃延伸90s，共循環(huán)30次；最后72℃延伸10min。擴(kuò)增片段長度為13000bp，包括1個內(nèi)含子和2個外顯子。

7、 5.擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性酶切：應(yīng)用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和PvuⅡ分別對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶(EB)染色，紫外線下觀察結(jié)果，一次性成像。 6.數(shù)據(jù)處理：用基因計數(shù)法計算檢驗(yàn)人群的基因型和等位基因頻率，應(yīng)用統(tǒng)計軟件進(jìn)行x2檢驗(yàn)，研究ER基因的多態(tài)性分布與發(fā)育性髖關(guān)節(jié)脫位的關(guān)系。 結(jié)果： 1.雌激素受體PvuⅡ限制性內(nèi)切酶酶切多態(tài)性分布與DDH的發(fā)病相關(guān)性：DDH組和對照組雌激素受

8、體PvuⅡ內(nèi)切酶酶切多態(tài)性分布存在差異，說明雌激素受體PvuⅡ內(nèi)切酶酶切多態(tài)性與DDH的發(fā)生之間存在相關(guān)性(p＜0.05)。PvuⅡ酶切后等位基因頻率：DDH組P基因的頻率85.4％，對照組為62.5％，卡方檢驗(yàn)p=0.011＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義，即P基因型與DDH發(fā)病有相關(guān)性。 2.雌激素受體XbaⅠ限制性內(nèi)切酶酶切多態(tài)性分布與DDH的發(fā)病相關(guān)性：DDH組和對照組雌激組雌激素受體XbaⅠ內(nèi)切酶酶切多態(tài)性分布無顯著性差異，說

9、明雌激素受體XbaⅠ內(nèi)切酶酶切多態(tài)性與DDH的發(fā)生之間無顯著相關(guān)性(p＞0.05)。XbaⅠ酶切后等位基因頻率：DDH組X基因的頻率77.1％，對照組為64.5％，卡方檢驗(yàn)p=0.178＞0.05，無統(tǒng)計學(xué)意義，即X基因型與DDH發(fā)病無明顯相關(guān)。 結(jié)論： 1.雌激素受體PvuⅡ內(nèi)切酶酶切基因型多態(tài)性與DDH的發(fā)生之間存在相關(guān)性，PvuⅡ酶切位點(diǎn)突變產(chǎn)生P基因型與DDH的發(fā)生相關(guān)。 2.雌激素受體XbaⅠ內(nèi)切酶酶切