rpoB基因-PCR-反向斑點雜交快速鑒定分枝桿菌菌種的研究.pdf

1、分枝桿菌的rpoB基因是分枝桿菌依賴DNA的RNA聚合酶的β亞單位的編碼基因序列，rpo(RNApolymerase，RNA聚合酶)是由αββ‘σ四個亞單位形成的寡聚體，其核心酶是α2ββ‘的聚合體，全酶為α2ββ‘σ聚合體。核心酶α2ββ‘就可完成RNA聚合酶的功能，但是需要σ亞單位在轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)確定轉(zhuǎn)錄起始位置，編碼αββ‘σ亞單位的基因就被分別稱為rpoA、rpoB、rpoC、rpoD基因。 結(jié)核分枝桿菌標準株H37Rv的R

2、NA聚合酶β亞單位由1178個氨基酸組成，編碼它的ORF(openreadingframe，開放閱讀框)長度為3534bp，我們選用其第902-1261堿基，長度為360bp的片段為目的基因。其兩端序列在分枝桿菌種間保守(擴增引物根據(jù)其序列確定)，中間包含兩個序列高變區(qū)，可以作為菌種鑒定的靶序列。 使用rpoB基因引物Ⅰ、引物Ⅱ?qū)?4種分枝桿菌標準株、8種非分枝桿菌標準株以及37株分枝桿菌臨床分離株標本進行rpoB基因擴增。24

3、種分枝桿菌標準株、37株臨床分離株均出現(xiàn)擴增，經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳可見一條360bp擴增條帶。8種非分枝桿菌標準株中的甲型溶血性鏈球菌和假白喉棒狀桿菌標準株出現(xiàn)少量擴增。 根據(jù)已知的各種分枝桿菌菌種rpoB基因序列、文獻報道及自行補充測序，設(shè)計了21種分枝桿菌寡核苷酸探針。將探針點膜應用反向斑點雜交技術(shù)檢測了擴增的24種分枝桿菌標準株、37株分枝桿菌臨床分離株以及出現(xiàn)擴增的2種非分枝桿菌標準株(甲型溶血性鏈球菌，假白喉棒狀桿菌標

4、)。 所有探針均只和相應菌種雜交，僅偶然分枝桿菌探針(pFor)與海分枝桿菌標準株擴增產(chǎn)物發(fā)生交叉雜交，但海分枝桿菌探針(pMar)與偶然分枝桿菌擴增產(chǎn)物無雜交，并不影響對鑒定結(jié)果的判讀。甲型溶血性鏈球菌和假白喉棒狀桿菌標準株擴增產(chǎn)物與各分枝桿菌探針無雜交。 其中37株臨床分離株經(jīng)PCR-反向斑點雜交鑒定為12株結(jié)核分枝桿菌，7株胞內(nèi)分枝桿菌，7株膿腫分枝桿菌，6株瘰疬分枝桿菌，2株堪薩斯分枝桿菌，1株戈登分枝桿菌，1株

5、偶然分枝桿菌，1株只與屬探針(pMyc)雜交鑒定為分枝桿菌屬。其中30株與常規(guī)鑒定結(jié)果相符，其余7株經(jīng)過DNA測序判定與探針雜交鑒定結(jié)果相符。 實驗所用引物對分枝桿菌擴增敏感性及特異性良好，所試分枝桿菌標準株及臨床株均出現(xiàn)360-bp擴增片段，甲型溶血性鏈球菌和假白喉棒狀桿菌出現(xiàn)擴增片段，但該片段與探針無雜交。所用探針能鑒定包括臨床常見分枝桿菌在內(nèi)的20種分枝桿菌。其中有能將16SrRNA基因無法鑒別的堪薩斯分枝桿菌和胃分枝桿菌