Caveolin-1對(duì)喉鱗癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及與EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的相關(guān)性研究.pdf

1、Caveolin-1是caveolae(細(xì)胞質(zhì)膜微囊)的功能蛋白，它與細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞的內(nèi)吞以及細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)節(jié)等功能相關(guān)。目前，caveolin-1和腫瘤之間的關(guān)系也逐漸成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。在許多腫瘤中發(fā)現(xiàn)caveolin-1的表達(dá)是下調(diào)的，而轉(zhuǎn)染caveolin-1基因能明顯的抑制某些腫瘤的惡性表型。因此，學(xué)多學(xué)者認(rèn)為caveolin-1可能是一個(gè)抑癌基因。但在另一些腫瘤中，特別是前列腺癌，caveolin-1的表達(dá)卻與惡

2、性程度是正相關(guān)的；這使caveolin-1在腫瘤中的角色變得異常模糊，它到底是癌基因還是抑癌基因?Caveolin-1在不同組織類型中可能起著不同的作用。 目前針對(duì)喉癌的研究很多，但其確切的發(fā)病機(jī)制尚不甚清楚。Caveolin-1的表達(dá)在喉鱗癌的發(fā)生、發(fā)展中會(huì)發(fā)生什么樣的變化；它和喉鱗癌病人的臨床參數(shù)是否存在一定的相關(guān)性：轉(zhuǎn)染caveolin-1基因會(huì)對(duì)喉鱗癌細(xì)胞造成什么樣的影響?有文獻(xiàn)報(bào)道，caveolin-1能影響細(xì)胞的凋亡

3、，但其機(jī)制目前還不明了，其對(duì)喉鱗癌細(xì)胞的凋亡會(huì)有什么樣的影響?這些問(wèn)題目前在國(guó)內(nèi)外尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。 因此，本課題中我們制備了caveolin-1的真核表達(dá)質(zhì)粒，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人喉鱗癌細(xì)胞株HEp2，通過(guò)體內(nèi)和體外研究觀察它對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和表型的影響；通過(guò)免疫組織化學(xué)研究喉鱗癌中caveolin-1表達(dá)的變化及其與臨床參數(shù)的關(guān)系，為喉鱗癌發(fā)生機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為臨床喉鱗癌的診斷和治療提供一定的理論基礎(chǔ)。 第一部分 ：caveol

4、in-1真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEp2細(xì)胞。 目的: 構(gòu)建caveolin-1真核表達(dá)質(zhì)粒，篩選出穩(wěn)定高表達(dá)caveolin-1的HEp2細(xì)胞。 方法： 用PCR法從pc-3細(xì)胞的cDNA中擴(kuò)增出人全長(zhǎng)caveolin-1基因，并連接到真核表達(dá)載體pcDNA3.0上；用脂質(zhì)體法把caveolin-1基因?qū)際Ep2細(xì)胞中，通過(guò)G418篩選得到caveolin-1高表達(dá)的細(xì)胞克隆，并用細(xì)胞免疫熒光、實(shí)

5、時(shí)熒光定量PCR和westemblot進(jìn)行鑒定。 小結(jié)： 成功構(gòu)建了caveolin-1真核表達(dá)質(zhì)粒，并篩選得到了穩(wěn)定高表達(dá)caveolin-1的HEp2細(xì)胞株。 第二部分：轉(zhuǎn)染caveolin-1基因?qū)Ep2細(xì)胞生物學(xué)行為影響的體內(nèi)外研究。 目的: 觀察穩(wěn)定轉(zhuǎn)染caveolin-1基因?qū)Ep2細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。 方法： MTT法檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)能力，軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

6、細(xì)胞錨定非依賴性生長(zhǎng)能力，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布和凋亡情況，免疫印跡法檢測(cè)Bcl-2、p53和p21蛋白表達(dá)，裸鼠移植瘤模型檢測(cè)細(xì)胞在體內(nèi)成瘤能力及生長(zhǎng)速度。 小結(jié) ： caveolin-1高表達(dá)能夠明顯抑制HEp2細(xì)胞在體內(nèi)、外的生長(zhǎng)能力，能夠使細(xì)胞停滯于G<,1>/G<,0>期，并且促進(jìn)凋亡，其促凋亡的機(jī)制可能與Bc1-2表達(dá)的下調(diào)有關(guān)。 第三部分：轉(zhuǎn)染caveolin-1基因?qū)gp2細(xì)胞EGFR及下游

7、MAPKs通路的影響。 目的: 觀察轉(zhuǎn)染caveolin-1基因在HEp2細(xì)胞中對(duì)EGFR及其下游MAPKs信號(hào)通路的影響。 方法： 免疫印記法檢測(cè)HEp2-CAV1-2、HEp2-CAV1-3組、空載對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的total-EGFR、p-EGFR、total-Erk1/2和p-Erk1/2蛋白水平；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)裸鼠移植瘤中p-EGFR和p-Erk1/2蛋白水平。細(xì)胞免疫雙標(biāo)法和免疫共沉淀

8、檢測(cè)caveolin-1與EGFR的結(jié)合情況。 小結(jié)： 在HEp2細(xì)胞中，存在caveolin-1和EGFR的結(jié)合，轉(zhuǎn)染caveolin-1基因能抑制EGFR的磷酸化并下調(diào)其下游MAPKs通路的活性。 第四部分：人喉鱗癌組織中caveolin-1和hTERT的表達(dá)和臨床參數(shù)的關(guān)系。 目的: 檢測(cè)caveolin-1和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)mRNA在人喉鱗癌組織中的表達(dá)變化，并分析其與各臨床

9、參數(shù)之間的關(guān)系。 方法： 收集臨床喉鱗癌新鮮手術(shù)切除組織標(biāo)本，置液氮中保存；用原位雜交法檢測(cè)人喉鱗癌組織中hTERT mRNA的表達(dá)，用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)組織中caveolin-1 的表達(dá)；分別統(tǒng)計(jì)分析兩者與臨床參數(shù)的相關(guān)性，以及兩者之間的相關(guān)性。 小結(jié)： 喉鱗癌中hTERT mRNA的陽(yáng)性率明顯高于正常組織和不典型增生，有助于喉部良惡性病變的鑒別；喉鱗癌中caveolin-1的陽(yáng)性率低于正常組織和不典型

10、增生，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但有待于進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量再分析。 結(jié)論： 1、成功構(gòu)建了caveoin-1真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0-CAV1，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEp2細(xì)胞后篩選得到 3 株高表達(dá)caveolin-1 的細(xì)胞克隆HEp2-CAV1-1、HEp2-CAV1-2和HEp2-CAV1-3。 2、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染caveolin-1基因能明顯抑制HEp2細(xì)胞體內(nèi)外生長(zhǎng)和錨定非依賴性生長(zhǎng)能力；使HEp2細(xì)胞停滯于G<,1>/G<,0

11、>期，并促進(jìn)凋亡；其促凋亡的機(jī)制可能與bc1-2的下調(diào)有關(guān)。 3、在HEp2細(xì)胞中，caveolin-1能于EGFR結(jié)合，轉(zhuǎn)染caveolin-1基因能抑制EGFR 的磷酸化，并下調(diào)其下游MAPKs信號(hào)通路的活性水平。 4、喉鱗癌中hTERTmRNA的陽(yáng)性率明顯高于正常組織和不典型增生，有助于喉部良惡性病變的鑒別；喉鱗癌中 caveolin-1 的陽(yáng)性率低于正常組織和不典型增生，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但建議有待于擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步