小鼠盲腸結(jié)扎穿孔模型血漿蛋白質(zhì)組變化的初步研究.pdf

1、研究目的1.建立血漿蛋白質(zhì)組研究平臺，掌握去除小鼠血漿白蛋白的方法以及進(jìn)行血漿2-DE所需要的各種條件。2.了解CLP術(shù)后不同時間段小鼠血漿蛋白質(zhì)組的變化規(guī)律，為進(jìn)一步研究膿毒癥的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 研究方法1.應(yīng)用SDS-PAGE、2-DE及膠圖分析軟件對各種條件下去除血漿白蛋白的效果做出評價，從中選擇最佳方案。2.制備盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)動物模型，假手術(shù)組只游離盲腸、不做結(jié)扎及穿孔作為對照組。在術(shù)后不同的時間點抽取血液，去

2、除血漿中的白蛋白后，再行2-DE。同組相同時間點的5個個體膠圖做一個虛擬平均膠，然后將同一時間點的CLP組與假手術(shù)組的虛擬平均膠匹配，再到個體膠圖中比對，確認(rèn)差異蛋白質(zhì)斑點，對其行膠內(nèi)消化、MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀鑒定、數(shù)據(jù)庫搜索。 研究結(jié)果1.使用DEAE-CibacronBlue3GA可去除80％的血漿白蛋白。去除白蛋白后，2-DE顯示的蛋白質(zhì)斑點由處理前的211±19個增加到392±11個，而且許多斑點的蛋白質(zhì)表達(dá)量

3、也明顯增加，并可發(fā)現(xiàn)更多的差異點。同一個體的平行膠圖的平行性、可重復(fù)性滿意，顯示的蛋白斑點在分布、表達(dá)量和染色、背景等方面基本一致。2.虛擬平均膠匹配分析發(fā)現(xiàn)，在術(shù)后4h，CLP組與假手術(shù)組有43個蛋白質(zhì)斑點未能匹配，但將這些差異點在個體膠中分析，均未能在4對以上的膠圖中出現(xiàn)。3.使用虛擬平均膠匹配分析發(fā)現(xiàn)，術(shù)后24h時CLP組與假手術(shù)組共有122個蛋白質(zhì)斑點未能匹配；在個體膠中加以分析后，證實CLP組較假手術(shù)組有39個斑點上調(diào)，其中1

4、8個為新出現(xiàn)的；CLP組中無下調(diào)的蛋白質(zhì)斑點。經(jīng)膠內(nèi)消化、質(zhì)譜鑒定、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索發(fā)現(xiàn)，有33個斑點得到鑒定，分屬于8種蛋白質(zhì)：補(bǔ)體C3、富亮氨酸α2糖蛋白、低分子量激肽原、α1酸性糖蛋白、α1抗胰蛋白酶、血清淀粉樣蛋白P、血紅素結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白。 4.術(shù)后24h小鼠血漿中有一組蛋白質(zhì)斑點表達(dá)量較術(shù)后4h時明顯增加，共有4個斑點，呈串珠樣排列，但在24hCLP組與假手術(shù)組之間無差異，經(jīng)鑒定，這4個斑點均為結(jié)合珠蛋白。

5、 結(jié)論1.去除小鼠血漿中的白蛋白后，可顯著增加2-DE對血漿中差異蛋白質(zhì)的顯示能力。2.本研究建立的血漿蛋白質(zhì)組研究平臺可用于疾病機(jī)制研究。3.小鼠血漿中的結(jié)合珠蛋白只與手術(shù)創(chuàng)傷等炎癥反應(yīng)有關(guān)，而與膿毒癥無關(guān)。4.與假手術(shù)組比較，CLP組手術(shù)后4h小鼠血漿蛋白質(zhì)組無明顯變化。5.與假手術(shù)組比較，CLP組手術(shù)后24h小鼠血漿中高表達(dá)的蛋白質(zhì)有：補(bǔ)體C3、富亮氨酸α2糖蛋白、低分子量激肽原、α1酸性糖蛋白、α1抗胰蛋白酶、血清淀粉樣蛋白P、