OLETF自發(fā)性糖尿病大鼠心肌病變及其瘦素與胰島素信號通路變化的研究.pdf

1、本文內(nèi)容包括：第一部分OLETF自發(fā)性糖尿病大鼠模型與心肌病變 糖尿病心肌病是獨立于高血壓、冠心病和其它種類的心臟病之外的特異的心臟病變，但由于缺乏特異的檢查方法和病理取材的困難，臨床研究具有較大難度，由于2型糖尿病發(fā)病率逐年上升，對2型糖尿病心肌病變的研究尤為重要。本研究目的在于建立一個大鼠2型糖尿病伴心肌病變的模型。 本研究選擇了類似人類2型糖尿病的OLETF糖尿病大鼠模型，經(jīng)較長時間的觀察和培養(yǎng)，并利用組織形態(tài)學

2、(超薄切片透射電子顯微鏡)和功能檢查(葡萄糖耐量試驗、生理記錄儀心功能檢查)等，詳細了解了該模型的特點，病情演變過程，心肌病變的存在及超微結(jié)構(gòu)的特征，證實了該種自發(fā)性糖尿病大鼠模型具有2型糖尿病相應(yīng)的特點：1)晚發(fā)高血糖；2)糖尿病病程長；3)輕度肥胖；4)血脂異常；5)有腎臟并發(fā)癥(結(jié)節(jié)性病變)等。 該模型同時存在著多種心肌病變表現(xiàn)，表現(xiàn)如下：在鼠齡24周的糖尿病形成初期，心肌發(fā)現(xiàn)的主要病理改變?yōu)槊氀軆?nèi)皮腫脹、管腔折疊，心

3、肌中圓形和類圓形白色脂肪滴顯著增多，散在于肌原纖維間，輕度的間質(zhì)膠原沉積；70周的晚期，糖尿病腎臟病變明顯存在時，心肌毛細血管基膜明顯增厚，形成向管腔內(nèi)的突起，線粒體融合、漂浮、變性外逸，結(jié)構(gòu)不清，心肌細胞內(nèi)多處出現(xiàn)脂褐素等老化現(xiàn)象，大量膠原纖維在間質(zhì)內(nèi)沉積，心室肌細胞攣縮、收縮壞死帶形成，伴有舒張功能的減退，但未見冠狀動脈病變，血壓基本正常。 第二部分OLETF自發(fā)性糖尿病大鼠模型心肌胰島素信號通路成分改變-糖尿病心臟基因芯片

4、差異表達分析 糖尿病心肌病的發(fā)病機制是復(fù)雜的，而基因芯片技術(shù)可以在短時間內(nèi)探測到在特定狀態(tài)下，發(fā)生差異表達的眾多基因。為了比較自發(fā)性糖尿病大鼠和正常大鼠心肌組織中基因表達的差異，探討糖尿病性心肌病的發(fā)病機制，本研究采用3只OLETF糖尿病大鼠的心肌組織作為試驗組，3只LETO大鼠心肌組織為對照組，鼠齡均為70周，采用匯合標本，使用Affymetrix公司的基因芯片進行檢測。步驟為從心肌組織中抽提純化總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成兩組動物

5、的cDNA及cRNA探針；cRNA探針與基因表達譜芯片雜交，結(jié)果由掃描儀掃描并用GCOS軟件進行分析統(tǒng)計。并采用RT-PCR驗證了2個差異表達的胰島素信號通路成分基因。 結(jié)果：檢測基因3萬多個，其中上調(diào)基因102個，下調(diào)基因103個。其中已知基因有明確意義者為：1)病程較長的OLEFT大鼠心肌胰島素信號通路的關(guān)鍵分子存在異常，表現(xiàn)為PI-3KP85亞基基因顯著表達減少達8倍之多，以及IRS-1mRNA表達下降；2)參與糖酵解的磷

6、酸丙酮酸烯醇化酶，參與酮體生成的HMG-CoA裂合酶、蛋白質(zhì)降解的泛素激活酶以及其他參與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運代謝的可溶性載體家族3成員1在糖尿病心肌中的表達量均明顯降低2倍以上。肌球蛋白是一種具有ATP酶活性，可與鈣離子結(jié)合，參與肌絲運動，平滑肌收縮的蛋白質(zhì)，在糖尿病心肌中的表達量也是明顯降低的；3)基因分析結(jié)果還表明，在OLEFT大鼠中，促進細胞增殖、分化，血管增生的相關(guān)基因明顯上調(diào)表達。Kruppel-1ikefactor5基因是細胞增殖的正

7、調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，當受血管緊張素Ⅱ刺激時，可結(jié)合PDGF-A導致心肌肥厚。它同表皮生長因子一樣可以激活MEK通路促進細胞分化、增殖，調(diào)節(jié)平滑肌表型，促進血管生成。而血管生成素樣蛋白4，谷氨酰氨基肽酶和富含半胱氨酸蛋白61、磷脂酶A2、整聯(lián)蛋白α1都有誘導細胞增殖、介導血管生成、促進細胞黏附、趨化、遷移的作用。以上這些基因均明顯2倍以上上調(diào)表達。 第三部分OLETF自發(fā)性糖尿病大鼠模型心肌瘦素JAK2/IRS-2/PI-3K與胰島素I

8、RS-1/PI-3K信號通路變化的研究 肥胖的2型糖尿病經(jīng)常存在高胰島素血癥和高瘦素血癥，心臟不但存在胰島素受體，也存在數(shù)種瘦素受體亞型。因此推測兩種激素可能會相互修飾各自的作用，即這兩種激素的信號系統(tǒng)可能存在交叉，正如在胰腺、肝臟等臟器發(fā)現(xiàn)的那樣。為了明確這一點，我們在類似人類2型糖尿病的輕度肥胖的OLETF糖尿病大鼠中對瘦素和胰島素的相互作用進行了初步的探討。方法上采用了主動脈逆行插管灌注分離培養(yǎng)OLETF糖尿病大鼠心肌細胞

9、，并分別鑒定了心肌細胞上存在的瘦素的長型和短型受體，應(yīng)用western-blot方法檢測體外培養(yǎng)心肌細胞在應(yīng)用胰島素和瘦素刺激及胰島素信號通路PI-3K抑制劑和瘦素信號通路JAK2抑制劑AG490后心肌細胞膜GLUT4含量。結(jié)果：1)胰島素、瘦素及二者的聯(lián)合刺激LETO大鼠心肌細胞可能通過使GLUT4基因表達增多或轉(zhuǎn)位增加的方式，使心肌細胞膜GLUT4蛋白含量增加。但上述激素刺激對OLETF糖尿病大鼠心肌細胞膜GLUT4蛋白含量升高的作

10、用不如LETO大鼠；2)PI-3K抑制劑LY294002預(yù)處理30分鐘對胰島素、瘦素及二者的聯(lián)合刺激誘導的LETO大鼠和胰島素刺激的OLETF糖尿病大鼠和心肌細胞膜GLUT4蛋白含量均有抑制效應(yīng)，但對瘦素和瘦素加胰島素刺激的OLETF糖尿病大鼠心肌細胞膜GLUT4蛋白含量無明顯作用；3)JAK2抑制劑AG490預(yù)處理30分鐘可使LETO瘦素組心肌細胞膜葡萄糖GLUT4蛋白含量明顯下降，而對LETO其它組和OLETF糖尿病大鼠各刺激組心肌

11、細胞膜GLUT4蛋白含量均無抑制效應(yīng)，表明：OLETF糖尿病大鼠胰島素信號通路和與胰島素交叉的瘦素信號通路均可能存在原發(fā)受損。 結(jié)論 1)初步鑒定了大鼠2型糖尿病伴心肌病變模型：特征：①具有2型糖尿病特征；②無高血壓；③輕度心臟舒張功能受損；④顯著心臟病理改變，纖維化和微血管病變；⑤未見冠狀動脈病變。 2)成功建立了OLEFT糖尿病大鼠和對照LETO大鼠的心肌培養(yǎng)模型，活力達到實驗要求。 3)證實了在ST

12、Z、OLETF糖尿病大鼠及SD、LETO對照鼠心肌中分別存在瘦素短型和長型受體，并且定位于心肌細胞膜上。 4)基因芯片結(jié)果顯示：①鼠齡較大的OLEFT糖尿病大鼠心肌胰島素信號通路的關(guān)鍵分子存在異常，表現(xiàn)為PI-3KP85亞基基因顯著表達減少達8倍之多和IRS-1mRNA表達下降，提示胰島素抵抗可能存在于心肌，而且，OLEFT肥胖糖尿病大鼠心肌胰島素抵抗的部位可能主要在PI-3K。②參與糖酵解、脂代謝、蛋白代謝和心肌收縮蛋白的相關(guān)

13、基因的下調(diào)，提示糖尿病心肌的代謝紊亂。而細胞增殖、分化，血管增生的有關(guān)基因上調(diào)表達，與糖尿病心肌病理改變可能有密切聯(lián)系。 5)在OLETF糖尿病大鼠及LETO對照鼠的心肌細胞中可能存在胰島素IRS-1/PI-3K和瘦素JAK2/IRS-2/PI-3K信號通路，這兩條通路可能促使GLUT4基因表達或轉(zhuǎn)位。并可能存在交叉。瘦素可能通過與胰島素信號通路的交叉，部分模擬胰島素對GLUT4的作用。PI-3K抑制劑LY294002和JAK2