膿毒癥中免疫調(diào)控分子Tim-3及輔助性T細(xì)胞亞群的動(dòng)態(tài)變化實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、膿毒癥（sepsis）是指由感染、創(chuàng)傷等因素引起微生物侵入機(jī)體而引發(fā)的劇烈的全身性炎癥反應(yīng)。在發(fā)病過程中，機(jī)體免疫功能的異常是導(dǎo)致膿毒癥患者死亡率居高不下的主要原因之一。近期發(fā)現(xiàn)，單核巨噬細(xì)胞表面的關(guān)鍵免疫調(diào)控分子T細(xì)胞免疫球蛋白和粘蛋白-3（T cell Ig and mucin domain protein-3，Tim-3）在膿毒癥發(fā)病過程中發(fā)揮了重要的免疫調(diào)控作用。另外，膿毒癥患者的輔助性T細(xì)胞亞群的構(gòu)成和功能的變化也與病情嚴(yán)重程

2、度有關(guān)。
　　 目的:
　　 通過系統(tǒng)觀察膿毒癥不同嚴(yán)重程度情況下(sepsis、severe sepsis、septicshock)，免疫調(diào)控分子Tim-3在外周血單核細(xì)胞膜表面的表達(dá)情況，以及輔助性T細(xì)胞亞群功能相關(guān)細(xì)胞因子/轉(zhuǎn)錄因子(IFN-γ(Th1); GATA3(Th2); IL-17(Th17); Foxp3(Treg); IL-12，IL-10)的動(dòng)態(tài)變化，以期闡明膿毒癥患者在疾病發(fā)生發(fā)展過程中免疫功能的

3、變化規(guī)律，為膿毒癥的干預(yù)策略尋找合適的時(shí)間和方法。
　　 方法:
　　 本研究收錄2011年7月13日至2013年2月28日之間中國人民解放軍總醫(yī)院的急診監(jiān)護(hù)病房(EICU)、外科重癥監(jiān)護(hù)病房(SICU)和呼吸科重癥監(jiān)護(hù)病房(RICU)中新發(fā)的符合全身炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic Inflammatory ResponseSyndrome，SIRS)診斷標(biāo)準(zhǔn)的病例，采集入組第1天的外周血2-3ml，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(F

4、low Cytometr，F(xiàn)CM)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real Time-PCR，RT-PCR)技術(shù)檢測基因和蛋白水平的Tim-3;同時(shí)從基因水平檢測輔助性T細(xì)胞亞群的相關(guān)細(xì)胞因子/轉(zhuǎn)錄因子（IFN-γ，GATA3，IL-17，F(xiàn)oxp3，IL-12），應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-Linked Immunesorbent Assay, ELISA）檢測血清IL-10濃度;記錄這些患者在采血當(dāng)天的生命體征、血常規(guī)、血生化、動(dòng)脈血?dú)?/p>

5、等數(shù)據(jù)。流式細(xì)胞術(shù)檢測標(biāo)本包括健康對照組11例，SIRS組16例，sepsis組10例，severe sepsis組20例，septic shock組8例;實(shí)時(shí)熒光定量PCR和ELISA檢測的血液標(biāo)本包括健康對照組18例，sepsis組30例，severe sepsis組34例，septic shock組14例。采用SPSS20.0軟件對相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果:
　　 1)本研究發(fā)現(xiàn)，sepsis組Ti

6、m-3在外周血單核細(xì)胞膜表面的表達(dá)水平顯著升高（與健康對照組相比P＜0.01）;而在severe sepsis組和septic shock組Tim-3的表達(dá)顯著低于sepsis組（與sepsis組相比，p值分別為P＜0.05; P＜0.001），提示隨著膿毒癥的進(jìn)展，免疫調(diào)控分子Tim-3的表達(dá)出現(xiàn)先升高，而后隨著疾病加重而降低的趨勢。在所有sepsis患者中死亡組Tim-3陽性率顯著低于生存組(P＜0.01)及對照組(P＜0.001)

7、，進(jìn)而提示Tim-3表達(dá)的失調(diào)可能是疾病加重的一個(gè)標(biāo)志。
　　 根據(jù)Tim-3在外周血單核細(xì)胞膜表面的表達(dá)水平繪制受試者工作曲線（Receiver Operating Characteristic curve，ROC曲線），在評估患者病情嚴(yán)重程度的曲線下面積(Area Under Curve，AUC)為0.94，高于本實(shí)驗(yàn)中APACHEⅡ評分、SOFA評分和CRP的曲線下面積（AUC分別為0.619、0.845和0.702）;評

8、價(jià)患者預(yù)后的ROC曲線中AUC為0.838，與APACHEⅡ評分和SOFA評分接近(AUC分別為0.864和0.9)，即Tim-3在膿毒癥患者外周血單核細(xì)胞膜表面表達(dá)量對預(yù)測患者病情嚴(yán)重程度和預(yù)后有一定價(jià)值，Tim-3表達(dá)量愈低，病情愈嚴(yán)重，預(yù)后也愈差。
　　 2) sepsis組、severe sepsis組和septic shock組Tim-3在外周血單個(gè)核細(xì)胞基因表達(dá)水平均高于對照組（P值分別為P＜0.001、P＜0.01

9、、P＜0.05），隨著病情嚴(yán)重程度的加重，又呈現(xiàn)降低的趨勢。
　　 3)外周血輔助性T細(xì)胞亞群中:sepsis組、severe sepsis組和septic shock組的Th1相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ水平均高于對照組，severe sepsis組的均值高于sepsis組和septic shock組，死亡組高于生存組。sepsis組和severe sepsis組的IL-12水平顯著高于對照組（P值均為P＜0.05），而septic

10、 shock組顯著低于severe sepsis組(P＜0.05)。
　　 4) sepsis組和severe sepsis組的Th2亞群特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA3水平均高于對照組(P＜0.05)，而septic shock組顯著低于sepsis組，P＜0.001。
　　 Th1亞群和Th2亞群以及相關(guān)細(xì)胞因子IL-12在sepsis組和severe sepsis組的高表達(dá)，而在septic shock組的降低，提示在膿毒

11、癥發(fā)病初期機(jī)體的免疫系統(tǒng)仍然處于過度炎癥反應(yīng)狀態(tài)，當(dāng)出現(xiàn)膿毒癥休克時(shí)免疫系統(tǒng)功能狀態(tài)表現(xiàn)為免疫抑制;
　　 5) Th17亞群相關(guān)細(xì)胞因子IL-17在各實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)水平均高于對照組，隨著病情加重也呈升高趨勢，septic shock組顯著高于severe sepsis組(P＜0.05)。
　　 6) sepsis組和severe sepsis組的Treg亞群相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)水平均高于對照組（P值分別為P＜0.

12、05和P＜0.01），而septic shock組相較于severe sepsis組呈降低趨勢。
　　 7)抗炎性細(xì)胞因子IL-10的濃度在各實(shí)驗(yàn)組均高于對照組，severe sepsis組顯著高于sepsis組(P＜0.05)，而septic shock組較severe sepsis組有降低趨勢。
　　 結(jié)論:
　　 1.外周血單核細(xì)胞上免疫調(diào)控分子Tim-3的表達(dá)變化與膿毒癥病程的進(jìn)展呈現(xiàn)一定的關(guān)聯(lián);Tim-

13、3的表達(dá)對評價(jià)膿毒癥患者病情嚴(yán)重程度和評估預(yù)后有一定價(jià)值，Tim-3表達(dá)量愈低，病情愈嚴(yán)重，預(yù)后也愈差，其機(jī)制及意義有待于進(jìn)一步的深入研究;
　　 2.對不同嚴(yán)重程度的膿毒癥患者輔助性T細(xì)胞亞群的分析發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥和嚴(yán)重膿毒癥發(fā)病初期，機(jī)體炎癥反應(yīng)和抗炎反應(yīng)失衡，免疫系統(tǒng)仍處于過度炎癥反應(yīng)狀態(tài)，在伴有感染性休克發(fā)生時(shí)，機(jī)體出現(xiàn)顯著的免疫抑制。
　　 3.通過監(jiān)測膿毒癥不同嚴(yán)重程度情況下免疫調(diào)控分子Tim-3的表達(dá)以及輔助