外源性基因經乳腺管注射在大鼠乳腺中表達的機理研究.pdf

1、乳腺生物反應器屬于轉基因動物的范疇，自轉基因技術創(chuàng)立以來，幾十年里取得了巨大進展，擁有著廣闊的應用前景。從轉基因動物的乳腺中獲得珍貴醫(yī)用人類蛋白質是現代生物技術學應用的重要領域。乳腺導管注射可以用來制作乳腺生物反應器，本實驗的目的是為了研究外源性基因經乳腺導管注射在大鼠乳腺中表達的機理，探索提高基因轉染效率的對策。 本實驗的研究內容分為三個部分。 在第一部分實驗中，取8個不同發(fā)育時間點(4周齡、9周齡未孕、妊娠7天、妊娠

2、12天、妊娠18天、產后1周、產后2周、產后3周)的雌性大鼠乳腺組織進行普通石蠟切片、HE染色，在光鏡下觀察其形態(tài)學變化。結果發(fā)現：大鼠的乳腺是復管泡腺，其發(fā)育過程中形態(tài)學變化最明顯的時間是在妊娠12天至產后14天，表現為大量漿液性腺泡的腺細胞不斷增生及分泌活動，其中在妊娠12天和產后1周可以發(fā)現數量相對較多的處于分裂期的腺細胞。大鼠的乳腺發(fā)育過程主要是在孕期和泌乳期完成的，發(fā)育隨妊娠的開始而進行，隨泌乳的結束而退化。另取同一發(fā)育時期的

3、大鼠乳腺制作卡紅染色的全組織片，觀察了乳腺導管在發(fā)育過程中的整體變化。發(fā)現4周齡時，大鼠乳腺主要由細長而稀疏的導管構成，導管極少有側枝；9周齡時乳腺導管的主干上發(fā)出較多側枝，并且末端出現端芽；妊娠后，乳腺導管增粗，側枝更加密集，末球出現并逐漸增多；產后，乳腺導管基本維持在妊娠末期的形態(tài)特點；哺乳結束后乳腺導管恢復成妊娠前的狀態(tài)。 第二部分進行了外源性基因在體外培養(yǎng)細胞中表達的實驗，外源性基因選擇的是pCE-29質粒，它是高效的綠

4、色熒光蛋白(GFP)真核表達載體。實驗中首先擴增已轉染有pCE-29質粒的DH5α細菌，而后采取抽提的方法，得到含pCE-29質粒的溶液。經過紫外/可見分光度計測得溶液濃度為5.288ug/ul，純度為1.8240(A260/A280)，符合基因轉染的實驗要求。質粒經限制性內切酶XbaⅠ酶切，所得產物在0.8％瓊脂糖凝膠中電泳，電泳后的結果表明：質粒結構完整、序列正確；而后利用NucleofectoTMManual轉染儀對處于指數生長期

5、的小鼠乳腺癌細胞MA782進行了質粒轉染，結果培養(yǎng)細胞可以表達綠色熒光蛋白(GFP)。提示在體外條件下，對于一個細胞群體而言，如果其中處于分裂期的細胞較多，那么可能這一細胞群體接受外源基因的機率也較大。 在第三部分的實驗中，依據乳腺發(fā)育時期的不同(即未孕、妊娠7天、妊娠12天、妊娠18天、產后1周、產后2周)將36只雌性SD大鼠分為6個實驗組(6只/組)，以質粒pCE-29與脂質體Invivo-jetPEITM依不同比例混合后制

6、成不同的轉染液，分別經乳腺管注射和乳腺組織直接注射兩種方式導入各組大鼠的不同乳腺，48小時后處死大鼠，取材、冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察各組大鼠乳腺中GFP的表達情況。如果有GFP表達則對該張冰凍切片再進行HE染色，通過前后圖像對比來準確定位GFP的表達位置。結果在妊娠12天和產后1周這兩組中，pCE-29質粒與脂質體Invivo-jetPEITM依(N/P=10)的比例混合后經乳腺導管注射，質粒可以轉入腺泡細胞中而得到表達，而經乳腺組織

7、直接注射的實驗對象中未發(fā)現有GFP的表達。分析以上結果，認為采用乳腺注射進行轉基因實驗時，為提高外源基因的轉染效率可能應關注以下幾個方面：1、基因轉染的時機：可能應選擇乳腺內細胞分裂活動旺盛的時期。2、乳腺干細胞的影響：可能應選擇在干細胞/祖細胞不斷分化的時期。3、轉染液中DNA與脂質體的配比：應根據轉染對象的不同選擇外源基因與脂質體的合適配比。4、外源基因導入的途徑：經乳腺導管導入可能相對于乳腺組織直接注射效果更佳。5、乳腺中不同種類

8、細胞的特性：可能乳腺中的不同細胞對外源基因的易感性是不同的。 本實驗首次對外源基因經乳腺導管注射在乳腺細胞中表達的機制進行了研究，提出了當乳腺細胞處于旺盛分裂增殖的起始階段時，可能這些不斷分裂的細胞接受外源性基因的機率較大，這些細胞可能來源于腺細胞中的干細胞或者祖細胞。在轉基因的體內實驗研究中創(chuàng)新性的采用了對同一切片不同狀態(tài)下的圖像進行圖像分析來精確判定基因表達結果的新方法。實驗中首先將新鮮冰凍組織切片在熒光顯微鏡熒光激發(fā)下觀察