大鼠肝癌肺轉(zhuǎn)移灶中邊緣群細胞的分離與鑒定.pdf

1、近年來腫瘤干細胞理論備受人們關注,越來越多的研究結(jié)果表明：肝癌發(fā)生與肝干細胞之間關系密切，肝癌中可能存在肝癌干細胞。肝干/祖細胞研究中發(fā)現(xiàn)的一些較為特異的標志物，也常常能在肝癌細胞系中檢出。但由于以往對正常肝干細胞的解剖學定位及特異性標志仍不明確，目前尚無肝癌干細胞分離成功的報道。自Goodel等首次報道了利用Hoechst33342染色分選邊緣群（side population,SP）可以從骨髓中富集造血干細胞以來，邊緣群細胞分選相繼

2、在多種實體瘤的腫瘤干細胞分離中獲得成功；本實驗室近年來通過許多研究已證實利用邊緣群分選可以從多種肝癌細胞系及原發(fā)性肝癌標本中富集到肝癌干細胞，而進一步的研究顯示肝癌干細胞不僅是原發(fā)性肝癌的始動細胞，也可能直接參與了肝癌的侵襲與轉(zhuǎn)移，但目前還未見有從肝癌遠處轉(zhuǎn)移灶中分離出具有干細胞特征肝癌細胞的報道。本實驗研究擬探討利用化學致癌劑二乙基亞硝胺（DEN）誘導的大鼠肝癌肺轉(zhuǎn)移模型，采用邊緣群分選方法從大鼠肺轉(zhuǎn)移灶中分離干細胞樣肝癌細胞，并對其

3、干細胞特征、侵襲轉(zhuǎn)移能力進行鑒定。
　　方法：
　　1、大鼠肝癌肺轉(zhuǎn)移模型的建立將20只適齡雄性SD大鼠隨機平均分成4組，隨機抽取其中3組為實驗組，剩余為對照組；實驗組大鼠均給予0.1％DEN生理鹽水灌胃，3次/周，共計四周；對照組大鼠予以正常喂養(yǎng)，所有大鼠均在20周后處死，解剖胸腹腔，觀察肝臟及肺部病變。
　　2、肺轉(zhuǎn)移肝癌細胞的原代培養(yǎng)切取肺部轉(zhuǎn)移灶，減碎成1mm3大小的組織塊，0.25％Ⅳ型膠原酶37℃下消化組織

4、塊10分鐘，Hank’s緩沖液洗滌組織塊3次，將組織塊接種至培養(yǎng)瓶，加入含10％胎牛血清的Wiliam’sE培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，常規(guī)換液。
　　3、肺轉(zhuǎn)移性肝癌組織邊緣群細胞分選0.25％胰酶－EDTA液將肝癌肺轉(zhuǎn)移灶細胞消化成單細胞懸液，參照Goodel等的文獻報道，進行Hoechst33342染色，染色結(jié)束后向細胞懸液中分別加入PE標記的c-kit和Sca-1抗體，在流式細胞儀中進行檢測及分析。
　

5、　4、肺轉(zhuǎn)移肝癌SP細胞表達干細胞標志物的檢測在流式細胞儀上分析邊緣群細胞的同時，在PE通道分別檢測邊緣群及非邊緣群細胞c-kit、Sca-1的表達百分比。
　　5、SP及非SP表型的肺轉(zhuǎn)移肝癌細胞在無血清培養(yǎng)基中的體外培養(yǎng)將分選得到的細胞分別接種至兩個預先包被好Matrigel的兩個培養(yǎng)皿中，并添加含HGF的無血清DMEMF12培養(yǎng)基，放至37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)，每天在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長情況，每隔兩天更換無血清DM

6、EMF12培養(yǎng)基一次。
　　6、軟瓊脂克隆形成實驗在細胞培養(yǎng)板中制備0.6％底層瓊脂培養(yǎng)基，將分選得到的邊緣群和非邊緣群肺轉(zhuǎn)移肝癌細胞懸液計數(shù)，并調(diào)整細胞密度至1×104/ml，分別取兩組各40μl細胞懸液，在37℃與1ml0.3％頂層瓊脂培養(yǎng)基混勻后，立即澆入培養(yǎng)板中已凝固的底層瓊脂上，振勻，確保頂層培養(yǎng)基覆蓋整個底層培養(yǎng)基，置室溫下定型凝固；將培養(yǎng)皿放入37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)，每天在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，計數(shù)克隆

7、數(shù)目；重復5次，計算平均克隆數(shù)目，Studentt檢驗比較SP細胞和non-SP細胞平均克隆數(shù)目。
　　7、自我增殖實驗將分選得到的SP細胞和non-SP細胞分別在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周后，再次予以Hoechst33342染色后，分析兩組細胞中邊緣群細胞的含量。
　　8、Transwell侵襲實驗在細胞培養(yǎng)板中制備Martrigel膠，將肺轉(zhuǎn)移肝癌SP細胞、non-SP細胞、未分選肺轉(zhuǎn)移肝癌細胞分別加入含培養(yǎng)液及趨化因子的該

8、培養(yǎng)板中，37℃條件下培養(yǎng)12小后，鏡下觀察計算平均穿膜細胞數(shù)。細胞侵襲試驗中獲得的穿膜細胞數(shù)數(shù)據(jù)用±xs表示，應用SPSS10.0軟件進行ANOVA分析。
　　9、體內(nèi)成瘤實驗將分選得到的SP肝癌肺轉(zhuǎn)移細胞和non-SP肝癌肺轉(zhuǎn)移細胞用無菌技術接種至裸鼠右側(cè)背部皮下，每組各10只裸鼠，每只裸鼠的接種細胞總數(shù)經(jīng)流式細胞儀計數(shù)分選均為2×104個，每隔3天觀察皮下腫瘤的生長情況，一周后處死裸鼠,稱量皮下腫瘤重量及體積。
　　結(jié)

9、果：
　　1、大鼠肝癌晚期出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移對照組大鼠生長情況良好，病理解剖各組織器官未見異常；實驗組大鼠處死后解剖發(fā)現(xiàn)：肝臟均出現(xiàn)不同程度的肝硬化，肝臟表面滿布癌結(jié)節(jié)，其中2只大鼠雙肺表面可見粟粒樣轉(zhuǎn)移性癌結(jié)節(jié)，部分肺組織經(jīng)固定包埋切片后，行H.E染色鏡檢證實為肝癌肺轉(zhuǎn)移灶。
　　2、肺轉(zhuǎn)移灶肝癌細胞體外培養(yǎng)的鏡下觀察組織塊接種至培養(yǎng)瓶24小時后，可見組織塊邊緣有大量細胞釋放；在后續(xù)培養(yǎng)中陸續(xù)可見到大量細胞從組織塊中釋放、貼壁、伸

10、展成上皮樣細胞，培養(yǎng)7天去除組織塊后，在原植塊位置可見到明顯的上皮樣細胞島形成。
　　3、肺轉(zhuǎn)移性肝癌SP細胞的分離細胞經(jīng)Hoechst33342染色后在流式細胞儀上檢測的結(jié)果：以Hoechstred為X軸、Hoechstblue為Y軸所作的二維散點圖中，在遠離肝癌細胞集中區(qū)域的左下角部分，可見到一小部分光點聚集，它們表現(xiàn)為低Hoechstblue和低Hoechstred的特征，與其它絕大多數(shù)肝癌細胞的散射熒光特征明顯不同，該群位

11、于邊緣的“特殊”細胞即“邊緣群細胞”(SP細胞)。
　　4、肺轉(zhuǎn)移性肝癌SP細胞高表達干細胞標志物SP細胞表面c-kit表達率為85％，Sca-1表達率為75％，而non-SP細胞表面c-kit及Sca-1表達率分別僅為8％和3％。
　　5、具有SP和non-SP表型的肺轉(zhuǎn)移肝癌細胞在體外無血清培養(yǎng)基中的培養(yǎng)SP表型的肺轉(zhuǎn)移肝癌細胞在無血清培養(yǎng)基中仍保持有增殖的能力，而non-SP細胞組未觀察到明顯的增殖現(xiàn)象;培養(yǎng)10天后，

12、倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)SP表型的肝癌細胞在無血清培養(yǎng)基中形成了多個島嶼樣的細胞克隆;而non-SP肝癌細胞組此時仍未見有顯著的增殖，倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)有未貼壁的死亡細胞。
　　6、肺轉(zhuǎn)移肝癌SP細胞軟瓊脂克隆形成能力高于non-SP細胞SP肺轉(zhuǎn)移肝癌細胞在軟瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周后，大部分細胞形成了明顯的細胞克隆，細胞克隆呈桑椹樣，每個克隆由16-20個細胞組成，細胞呈透亮的球形，平均克隆形成率達到了69.90％；而non-SP表型

13、的肺轉(zhuǎn)移肝癌細胞在軟瓊脂培養(yǎng)基中未能形成明顯的細胞克隆，大部分細胞趨于凋亡、崩解，該組細胞的平均克隆形成率僅為15.25％。t=20.46，n=5，P<0.01。
　　7、自我增殖實驗將上述SP細胞和non-SP細胞用Hoechst33342染色并經(jīng)流式細胞儀檢測后，SP細胞組仍能檢測到特征性的SP細胞群，而非SP肝癌細胞組在體外無血清條件下培養(yǎng)后，不僅無法再檢測到特征性的SP細胞群,且在流式細胞檢測中出現(xiàn)了明顯的死亡細胞群。

14、r>　　8、Transwell侵襲實驗肺轉(zhuǎn)移肝癌SP細胞侵襲穿膜細胞數(shù)目均明顯高于non-SP細胞及未分選細胞，顯示肝癌肺轉(zhuǎn)移SP細胞體外侵襲能力強于non-SP細胞及未分選細胞。F=9.519481，P=0.002142。
　　9、裸鼠體內(nèi)成瘤實驗腫瘤細胞種植一個月后，SP細胞種植組裸鼠成瘤率，瘤體重量及體積明顯高于non-SP細胞種植組。SP細胞體內(nèi)成瘤能力明顯高于non-SP細胞。
　　結(jié)論：
　　來源于肝癌肺轉(zhuǎn)

15、移腫瘤組織的SP肝癌細胞群中富含具有干細胞特征的“特殊”細胞，這些“特殊”的細胞既具有形成和重建肝癌組織的能力，也具有較強侵襲轉(zhuǎn)移能力，還通過自我增殖保持自我更新，它們在肝癌肺轉(zhuǎn)移組織中發(fā)揮了類似正常組織中干細胞的角色和作用。肝癌肺轉(zhuǎn)移組織可能具有較強的異質(zhì)性，其中包含肝癌干細胞和非干細胞，利用Hoechst33342染色結(jié)合流式細胞術分選的方法可得到具備肝癌干細胞特征的SP細胞，SP細胞相對于肝癌肺轉(zhuǎn)移組織中的non-SP細胞具備較強