p38MAPK和STAT3在LPS刺激小鼠肺泡巨噬細(xì)胞功能變化中的作用.pdf

1、目的：急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是各種致病因素(如創(chuàng)傷、感染、缺血再灌注、燒傷等)導(dǎo)致的急性進(jìn)行性呼吸衰竭，嚴(yán)重的ALI被定義為急性呼吸窘迫綜合征(acuterespiratory distress syndrome,ARDS)，其發(fā)病機(jī)制至今尚不完全清楚。脂多糖(lipopolysaca charide，LPS)是革蘭氏陰性桿菌細(xì)胞壁上的成分，它能夠誘發(fā)重癥肺炎，從而引起ARDS。ALI起病急，進(jìn)展快，至

2、今尚無(wú)特異性治療。近幾年盡管采用了新的通氣技術(shù)和其它治療措施如糖皮質(zhì)激素等，ARDS的死亡率仍高達(dá)40％-60％。如何防止ALI的發(fā)展引起人們的高度重視。有研究表明ALI的后果依賴于致炎因子和抗炎因子的平衡。炎癥因子種類很多，但產(chǎn)生炎癥因子的信號(hào)途徑較少。因此我們從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑方面研究ALI的發(fā)病機(jī)制，為臨床防治ALI提供理論依據(jù)。 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPKs

3、)是多種信號(hào)途徑的交匯點(diǎn)。在微生物感染所致的免疫反應(yīng)中，巨噬細(xì)胞中的MAPKs發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子(signal transducers and activators oftranscription，STAT)是一類脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白，是細(xì)胞因子產(chǎn)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者。關(guān)于LPS與細(xì)胞因子生成的研究結(jié)果顯示，干預(yù)LPS的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是人為控制炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的重要途徑，大量研究顯示MAPKs在LPS信號(hào)的細(xì)胞內(nèi)傳遞中具有

4、重要作用，是人為控LPS炎癥反應(yīng)的潛在靶位。LPS主要和肺泡巨噬細(xì)胞發(fā)生作用，巨噬細(xì)胞組成肺組織第一道防線。本實(shí)驗(yàn)以LPS刺激小鼠肺泡巨噬細(xì)胞株(MH-S cells)為研究對(duì)象，觀察細(xì)胞內(nèi)p-STAT3表達(dá)水平及細(xì)胞上清液中腫瘤壞死因子α(TNF-α)的變化，及用p38的特異性抑制劑SB203580干預(yù)后p-STAT3表達(dá)的變化。從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑探討LPS致ALI的機(jī)制，為臨床防治ALI提供理論依據(jù)。 方法： 1.酶聯(lián)免

5、疫吸附試劑盒(ELISA試劑盒)檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNA-α的濃度。首先常規(guī)培養(yǎng)傳代MH-S細(xì)胞株，細(xì)胞傳代時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5x106/ml，于24孔板中培養(yǎng)過(guò)夜，隨機(jī)分為5組。①對(duì)照組：加入與實(shí)驗(yàn)組等體積的無(wú)血清1640培養(yǎng)液；②LPS組：LPS終濃度100ng/ml，分別刺激90min、2h 4h、6h、12h后取細(xì)胞上清液；③SB5+LPS組：培養(yǎng)液中加入終濃度為5μM的SB203580，20min后加入LPS，LPS

6、終濃度100ng/ml，用LPS刺激90min、2h、4h、6h、12h后取細(xì)胞上清液；④SB10+LPS組：培養(yǎng)液中加入終濃度為10μM的SB203580，20min后加入LPS，LPS終濃度100ng/ml，用LPS刺激90min、2h、4h、6h、12h后取細(xì)胞上清液；⑤SB15+LPS組：培養(yǎng)液中加入終濃度為15μM的SB203580，20min后加入LPS，LPS終濃度100ng/ml，用LPS刺激90min、2h、4h、6h

7、、12h后取細(xì)胞上清液。 -80℃保存細(xì)胞上清液，ELISA試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中TNF-α的含量。 2.Western blot方法檢測(cè)SB203580對(duì)LPS誘導(dǎo)MH-S細(xì)胞STAT3磷酸化的影響。實(shí)驗(yàn)共分5組：①對(duì)照組：加入與實(shí)驗(yàn)組等體積的兀血清1640培養(yǎng)液；②LPS15min組：LPS終濃度100ng/ml，刺激15分鐘；③LPS30min組：LPS終濃度100ng/ml，刺激30分鐘；④SB10+LPS1

8、5min組：SB203580終濃度10μM，LPS終濃度100ng/ml，刺激15分鐘，在LPS刺激前20分鐘用SB進(jìn)行干預(yù)；⑤SB10+LPS30min組：SB203580終濃度10μM，LPS終濃度100ng/ml，刺激30分鐘，在LPS刺激前20分鐘用SB進(jìn)行干預(yù)。各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞刺激成功后收集細(xì)胞，離心(1500rpm，4℃，10min)，棄去上清，-80℃保存細(xì)胞用于提取總蛋白，Western-blot技術(shù)，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)p-STAT

9、3表達(dá)。 3.免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)LPS誘導(dǎo)的MH-S細(xì)胞內(nèi)磷酸化STAT3的表達(dá)。于6孔板中上述各組細(xì)胞爬片，實(shí)驗(yàn)分組同Western blot，爬滿后做免疫細(xì)胞化學(xué)。 數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示。各組比較用單因素方差分析(One way ANOVA)，如有顯著性進(jìn)一步用Student-Newman-Keuls(SNK-q)檢驗(yàn)，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： (1)ELISA法顯示細(xì)胞

10、上清液中TNF-α含量變化。LPS刺激MH-S細(xì)胞后，細(xì)胞上清液中TNF-α含量增加，LPS刺激90min；TNF-α含量開(kāi)始升高，4h和6h達(dá)最高值，12h含量降低。經(jīng)單因素方差分析，對(duì)照組、LPS組與SB+LPS組，三組間TNF-α表達(dá)水平差異顯著(P＜0.05)，SB203580(10μM和 15μM)預(yù)處理，顯著抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α含量增加，與LPS組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且與SB的劑量呈正相關(guān)。SB20

11、3580(5μM)組，TNF-α含量雖有下降趨勢(shì)，但與LPS組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 (2)Western blot結(jié)果顯示LPS15min和LPS30min組磷酸化STAT3蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組和SB抑制組，LPS30min組表達(dá)水平高于LPS15min組。 (3)免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果表明：對(duì)照組細(xì)胞幾乎無(wú)黃染，LPS15min組細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)黃染，LPS30min組細(xì)胞黃染增強(qiáng)，用SB203580干預(yù)后細(xì)

12、胞黃染變淡。經(jīng)單因素方差分析，各組與對(duì)照組比較，p-STAT3表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；LP15min與SB10+LPS15min組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；LPS30min與SB10+LPS30min組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 結(jié)論： 1.LPS刺激MH-S細(xì)胞引起細(xì)胞上清中TNF-α泌增加；用p38MAPK的抑制劑SB203580干預(yù)后，TNF-α的分泌呈劑量依賴性減少。