中國(guó)Peutz-Jeghers綜合征患者STK11-LKB1基因突變篩查及PJ息肉蛋白質(zhì)組學(xué)分析.pdf

1、背景/目的:
　　 Peutz-Jeghers綜合征(Peutz-Jeghers Syndrome，PJS，MIM#175200)是一種以皮膚粘膜黑斑、胃腸道多發(fā)息肉為特征的罕見(jiàn)常染色體顯性遺傳病。胃腸道多發(fā)息肉在患者青少年時(shí)期常常引起腸套疊、腸梗阻、消化道出血;隨著年齡增長(zhǎng)，PJS患者不僅消化道息肉有惡變潛能，還可伴發(fā)生殖系統(tǒng)和其他許多器官的良性或惡性腫瘤，其家族的癌癥發(fā)病率也較普通人群為高。目前尚無(wú)干預(yù)措施能根治和預(yù)防PJS

2、發(fā)病及息肉惡變。因此，研究PJS相關(guān)致病基因、息肉發(fā)生及惡變的途徑和機(jī)制具有非常重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。
　　 PJS致病基因STK11/LKB1基因編碼的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)抑癌作用的蛋白激酶，其屬于AMPKK家族成員，通過(guò)對(duì)AMPK的變構(gòu)調(diào)節(jié)，實(shí)現(xiàn)對(duì)能量代謝的調(diào)控;還可能通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子SPI對(duì)VEGF產(chǎn)生負(fù)向調(diào)控，抑制細(xì)胞的增殖，也可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期，使細(xì)胞周期停滯G1期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖;在誘

3、導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞極性的形成中，通過(guò)與STRAD蛋白形成復(fù)合物而活化后，KB1S431A過(guò)量表達(dá)（一種絲氨酸-丙氨酸突變），抑制軸分化;另有報(bào)道，STK11基因在非小細(xì)胞肺癌的極性調(diào)控中，可能通過(guò)JNK信號(hào)通路，對(duì)轉(zhuǎn)錄因子AP-1、c-Jun、JunD和ATF2進(jìn)行調(diào)控，提高轉(zhuǎn)錄活性參與細(xì)胞極性形成。然而，關(guān)于PJS息肉形成及惡變機(jī)制的研究仍處于初級(jí)階段。
　　 近年來(lái)，有報(bào)道PJ息肉為腺瘤樣息肉，可發(fā)生癌變;另有報(bào)道錯(cuò)構(gòu)瘤本身也可能演

4、變?yōu)橄倭龊桶创嬖谥慑e(cuò)構(gòu)瘤→腺瘤→腺癌的演變過(guò)程;還有學(xué)者認(rèn)為有兩種機(jī)理導(dǎo)致PJS患者惡變，即錯(cuò)鉤瘤→腺瘤→腺癌途徑和de nove的惡變途徑。然而，PJS錯(cuò)構(gòu)瘤性息肉發(fā)生不典型增生/腺瘤樣變的頻率較低，因此，研究PJS息肉惡變的途徑和機(jī)制一直是該領(lǐng)域的瓶頸。
　　 隨著對(duì)PJS疾病的深入研究，探討STK11/LKB1基因的突變類(lèi)型、突變位點(diǎn)與PJS患者發(fā)生惡性腫瘤的關(guān)系，已成為該領(lǐng)域基礎(chǔ)研究和臨床研究的焦點(diǎn)。Lim W等報(bào)

5、道PJS患者STK11/LKB1基因第三號(hào)外顯子突變，發(fā)生惡性腫瘤風(fēng)險(xiǎn)高;Mehenni H則認(rèn)為該基因第六號(hào)外顯子突變與惡性腫瘤相關(guān);Schumacher發(fā)現(xiàn)其羧基端和VIB-Ⅷ功能區(qū)的錯(cuò)義突變與惡性腫瘤的關(guān)聯(lián)更為密切，而移碼缺失與剪切位點(diǎn)突變被認(rèn)為與惡性腫瘤的發(fā)生無(wú)關(guān)，乳腺癌的發(fā)生主要由截短突變引起。然而，這些發(fā)現(xiàn)并沒(méi)有被其他獨(dú)立的PJS人群所證實(shí)。
　　 目前，PJS致病基因STK11/LKB1在不同研究人群中顯示出較大差

6、異的突變率(50％-90％)，基因型和表型的關(guān)系尚無(wú)定論，且PJS患者息肉惡變風(fēng)險(xiǎn)、惡變途徑尚存爭(zhēng)議。這些群體間的差異，不僅由于潛在的群體遺傳學(xué)分層，樣本量偏小也是重要原因，導(dǎo)致研究結(jié)果存在一定程度的分歧、無(wú)法在大規(guī)模人群中重復(fù)?？梢?jiàn)，增加標(biāo)本量，建立PJS家系生物標(biāo)本庫(kù)，做好隨訪(fǎng)工作，是進(jìn)行這一罕見(jiàn)遺傳病研究迫切需要解決的問(wèn)題。
　　 本課題探討建立PJS家系生物標(biāo)本庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)化程序，研究并制定規(guī)范化的組織及血液樣品等生物標(biāo)本采

7、集、處理、保存操作流程，建立功能完善、信息豐富的PJS家系生物標(biāo)本庫(kù)。在此基礎(chǔ)上，對(duì)PJS患者進(jìn)行臨床病理特征分析，探討PJ息肉的病理演變過(guò)程，評(píng)估中國(guó)PJS患者發(fā)生惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn);并進(jìn)行分子遺傳學(xué)分析，繪制STK11/LKB1基因突變圖譜，尋找中國(guó)PJS患者STK11/LKB1基因可能存在的突變熱點(diǎn)區(qū)域及基因型和表型的關(guān)系;應(yīng)用ProteinPathway Array技術(shù)進(jìn)行PJ息肉蛋白質(zhì)組學(xué)分析，識(shí)別與PJ息肉發(fā)生發(fā)展可能相關(guān)的信號(hào)

8、傳導(dǎo)通路蛋白以及潛在的分子治療靶點(diǎn)。
　　 方法:
　　 1、借鑒國(guó)內(nèi)外標(biāo)本庫(kù)建立的標(biāo)準(zhǔn)化程序，收集全國(guó)范圍內(nèi)PJS患者及家系正常人的血液標(biāo)本和息肉組織標(biāo)本，采用收集-反饋-修改的模式對(duì)標(biāo)本收集的操作流程不斷完善，并健全各種管理和質(zhì)量控制措施。
　　 2、分析61個(gè)中國(guó)PJS家系133例PJS患者的臨床病理資料，探討PJ息肉的病理演變過(guò)程，評(píng)估中國(guó)PJS患者發(fā)生惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。
　　 3、聯(lián)合應(yīng)用Sang

9、er測(cè)序和MLPA檢測(cè)技術(shù)，對(duì)52個(gè)PJS家系（遺傳性家系25個(gè)，散發(fā)性家系27個(gè)）共計(jì)116例PJS患者、95例PJS家系正常人，進(jìn)行STK11/LKB1基因突變篩查，并分析基因型和表型的關(guān)系。
　　 4、選取明確STK11/LKB1基因突變檢測(cè)結(jié)果的28例PJS新鮮息肉組織和35例結(jié)腸癌癌旁正常組織（無(wú)STK11/LKB1基因突變），應(yīng)用Protein PathwayArray技術(shù)篩選與PJ息肉相關(guān)的蛋白表達(dá)譜，并用West

10、ern Blot和IHC予以鑒定。
　　 5、統(tǒng)計(jì)方法:數(shù)據(jù)處理采用SPSS17.0軟件包，計(jì)數(shù)資料分別計(jì)算例數(shù)和所占比例，構(gòu)成情況間的差別用x2檢驗(yàn)或Fisher's精確檢驗(yàn)，應(yīng)用Student's t-test和Significant Analysis of Microarray(SAM)進(jìn)行差異蛋白質(zhì)的篩選。以P＜0.05，Q＜5為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)果:
　　 1、初步建立中國(guó)PJS家系生物標(biāo)本庫(kù)通過(guò)

11、制定標(biāo)準(zhǔn)化的標(biāo)本收集流程，我們收集了61個(gè)PJS家系(28個(gè)遺傳性家系和33個(gè)散發(fā)性家系)，133例PJS患者以及95例家系正常成員的生物標(biāo)本，包括全血、血清、新鮮息肉組織、息肉蠟塊組織以及正常粘膜組織，采集了完整的臨床病理資料，并記錄長(zhǎng)期跟蹤隨訪(fǎng)信息（尤其是息肉切除、息肉病理及惡性腫瘤發(fā)生的信息），初步建立了PJS家系生物標(biāo)本庫(kù)。定期隨機(jī)抽取樣本提取DNA和蛋白進(jìn)行檢測(cè)，證明所收集的標(biāo)本具有較高質(zhì)量。
　　 2、中國(guó)PJS患者

12、臨床病理特征的分析分析133例PJS患者的臨床病理資料，發(fā)現(xiàn)85例(64％，85/133)患者經(jīng)歷過(guò)至少一次外科剖腹手術(shù)（1-5次），第一次手術(shù)的平均年齡為17.29歲(3-68歲），多發(fā)息肉或體積較大息肉引起的小腸套疊或腸梗阻是導(dǎo)致外科手術(shù)的主要原因。16例(12％，16/133)患者的息肉出現(xiàn)錯(cuò)構(gòu)瘤伴輕/中度不典型增生，患者平均年齡30.4歲，息肉直徑均在3厘米以上，2枚息肉位于胃底，9枚分布于小腸，1枚位于直腸，其余息肉分布于結(jié)腸

13、。25例PJS患者(18.8％，25/133)合并了27例惡性腫瘤，消化道腫瘤占66.7％(18/27)，其次為乳腺癌和婦科腫瘤，占25.9％(7/27)，另有白血病和肺癌各一例;其中2例PJS患者分別合并兩種不同的惡性腫瘤，一例合并小腸癌、宮頸癌，另一例合并小腸癌、乳腺癌;患者發(fā)生惡性腫瘤的平均年齡為37.4歲（27-68歲）。
　　 3、Sanger測(cè)序法檢測(cè)STK11/LKB1基因突變應(yīng)用Sanger測(cè)序?qū)?2個(gè)PJS家系

14、進(jìn)行STK11/LKB1基因的突變篩查，27例先證者(51.9％，27/52)中檢測(cè)到25種不同的STK11/LKB1基因突變，包括8個(gè)錯(cuò)義突變和17個(gè)截短突變，突變均與家系表型共分離，且在50例正常對(duì)照中未發(fā)現(xiàn)相同突變;其中，10種突變(40％，10/25)與PJS患者合并惡性腫瘤相關(guān)，包括胃腸道惡性腫瘤、胰腺癌、肝癌、肺癌、宮頸癌及白血病;14種(56％，14/25)突變?yōu)槭状螆?bào)道的新的病理性突變，包括四個(gè)缺失突變(c.151-16

15、2de112，c.308_317del10，c.834_835delTG, c.898-906de19)、三個(gè)插入突變(c.402-403dupTG,c.892-893insC，c.402-403dupTG)、兩個(gè)無(wú)義突變(c.783 C＞G, c.904 C＞T)、兩個(gè)剪切位點(diǎn)突變(IVS2-1 G＞A，IVS5+2 T＞C)以及三個(gè)錯(cuò)義突變(c.862 G＞A,c.866T＞G, c.891 G＞C)。值得注意的是，8個(gè)突變(8/2

16、7，29.6％)位于STK11/LKB1基因第七號(hào)外顯子，是STK11/LKB1基因九個(gè)外顯子中最短的一個(gè)，僅編碼19個(gè)氨基酸，疑似中國(guó)PJS患者的突變熱點(diǎn)。
　　 4、MLPA技術(shù)檢測(cè)STK11/LKB1基因大片段缺失/重復(fù)應(yīng)用MLPA技術(shù)檢測(cè)25例Sanger測(cè)序未發(fā)現(xiàn)STK11/LKB1基因突變的PJS先證者，發(fā)現(xiàn)8例(15.4％，8/25)先證者存在該基因的大片段缺失，其中4例為1號(hào)外顯子缺失(c.-1114-?_290

17、+?del)，1例為3號(hào)外顯子缺失(c.375-?_464+?del)，1例為3-9號(hào)外顯子缺失(c.375-?_1365+? del)，1例為4-6號(hào)外顯子缺失(c.465-?_862+?del)，1例為6號(hào)外顯子缺失(c.735-?_862+?del);三個(gè)PJS家系合并惡性腫瘤的發(fā)生，包括結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌和宮頸癌。
　　 5、分析基因型和表型的關(guān)系遺傳性PJS家系STK11/LKB1基因突變率為80％(20/25)，

18、高于散發(fā)性家系的突變率55.6％(15/27)(p=0.06);在116例PJS患者中，18例(21.7％，18/83)攜帶STK11/LKB1基因突變的患者發(fā)生惡性腫瘤，5例(15.2％，5/33)未攜帶基因突變的患者合并惡性腫瘤(p=0.462);此外，5個(gè)插入突變和3個(gè)(3/4)無(wú)義突變所在的8個(gè)PJS家系中均合并了惡性腫瘤的發(fā)生，而所有剪切位點(diǎn)突變（5個(gè)）和小片段缺失突變（4個(gè)）所在的家系中未合并惡性腫瘤。
　　 6、S

19、TK11/LKB1基因第Ⅺ功能區(qū)突變與PJ息肉發(fā)生不典型增生相關(guān)將檢測(cè)出的27個(gè)STK11/LKB1基因突變位點(diǎn)按照STK11蛋白不同的功能區(qū)(Ⅰ-Ⅺ)進(jìn)行分組，發(fā)現(xiàn)10個(gè)(37％，10/27)突變位于STK11蛋白第Ⅺ功能區(qū)(277-309氨基酸殘基)，其中9個(gè)(90％，9/10)突變與胃腸道錯(cuò)構(gòu)瘤性息肉發(fā)生不典型增生相關(guān)，且攜帶不典型增生息肉的患者平均年齡26.8歲（16-44歲）;然而，在STK11蛋白第Ⅰ-Ⅹ功能區(qū)的17個(gè)基因突

20、變中，僅有2個(gè)(11.8％，2/17)突變與PJ息肉發(fā)生不典型增生相關(guān);兩組相比較，有顯著性差異(p=0.0001)。隨后，回顧性分析了HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)中PJS患者STK11/LKB1基因突變與惡性腫瘤的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)76.9％(10/13)的Ⅺ功能區(qū)突變與惡性腫瘤相關(guān)。
　　 7、p-p38MAPK蛋白在STK11/LKB1基因Ⅺ功能區(qū)突變的PJ息肉中表達(dá)顯著升高為進(jìn)一步探討STK11/LKB1基因第Ⅺ功能區(qū)突變與惡性腫瘤相關(guān)的機(jī)制

21、，應(yīng)用Protein Pathway Array技術(shù)對(duì)PJ息肉組織和正常腸粘膜組織進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，比較13例攜帶STK11/LKB1基因Ⅰ-Ⅹ功能區(qū)突變的PJ息肉與4例Ⅺ功能區(qū)突變的PJ息肉中蛋白表達(dá)的差異，發(fā)現(xiàn)Ⅰ-Ⅹ功能區(qū)突變的PJS息肉中p-p38MAPK蛋白表達(dá)高于正常腸粘膜1.83倍，而Ⅺ功能區(qū)突變的息肉中該蛋白表達(dá)高于正常腸粘膜3.23倍，兩組比較，p-p38MAPK蛋白表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.003)，并用Wes

22、tern Blot驗(yàn)證了該結(jié)果。
　　 8、Galectin-3蛋白可能成為抑制PJ息肉生長(zhǎng)的分子治療靶點(diǎn)除p-p38MAPK蛋白外，應(yīng)用Protein Pathway Array技術(shù)對(duì)28例PJS息肉組織和35例正常腸粘膜組織進(jìn)行蛋白表達(dá)的篩選中還發(fā)現(xiàn)39種差異蛋白，13種蛋白在PJ息肉組織中呈高表達(dá)，26種蛋白呈低表達(dá)，并用Western Blot和IHC驗(yàn)證了Galectin-3，GSTP1，NQO1，COX-2及ICAM

23、-1蛋白的表達(dá)，肯定了Proteinpathway array實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。其中，Galectin-3（半乳糖凝集素-3）蛋白在PJ息肉中的表達(dá)是正常粘膜的7倍，在PJS錯(cuò)構(gòu)瘤和發(fā)生不典型增生的息肉中均呈胞漿強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，且其抑制劑低分子柑橘果膠(MCP)毒副作用極小，故該蛋白有望成為抑制PJ息肉生長(zhǎng)的分子治療靶點(diǎn)。
　　 9、應(yīng)用IPA(Ingenuity Pathway Analysis)數(shù)據(jù)分析平臺(tái)預(yù)測(cè)PJ息肉發(fā)生機(jī)制綜

24、合PJ息肉中篩選出的差異蛋白，我們分析STK11/LKB1基因突變后可能激活p38MAPK蛋白，從而通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)（COX-2，ICAM-1）和代謝途徑（Galectin-3，GSTP1，NQO1）引起PJ息肉的形成，且p-p38MAPK蛋白可能在STK11/LKB1基因第Ⅺ功能區(qū)突變息肉發(fā)生不典型增生的病理演變過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　　 結(jié)論:
　　 1、規(guī)范化操作流程的建立有利于提高PJS家系生物標(biāo)本收集的效率、提

25、高標(biāo)本庫(kù)質(zhì)量（包括生物樣本和系統(tǒng)臨床隨訪(fǎng)資料），具有創(chuàng)新性和較強(qiáng)可操作性。
　　 2、首次報(bào)道中國(guó)PJS患者STK11/LKB1基因突變率，達(dá)67.3％，繪制了中國(guó)PJS患者STK11/LKB1基因突變圖譜，且第七號(hào)外顯子可能是中國(guó)PJS患者的突變熱點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)14種新的致病突變。
　　 3、提出一種新的基因型和表型的關(guān)系，即STK11/LKB1基因第Ⅺ功能區(qū)突變與PJS患者錯(cuò)構(gòu)瘤性息肉發(fā)生不典型增生相關(guān);并發(fā)現(xiàn)p-p38

26、MAPK蛋白可能在這一病理演變過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　　 4、發(fā)現(xiàn)Galectin-3蛋白可能成為抑制PJ息肉生長(zhǎng)的潛在治療靶點(diǎn)，其天然抑制劑低分子柑橘果膠(MCP)有望應(yīng)用于PJS患者臨床治療。
　　 5、中國(guó)PJS患者因腸梗阻/腸套疊首次行剖腹手術(shù)(64％)、PJ息肉出現(xiàn)錯(cuò)構(gòu)瘤伴輕/中度不典型增生(12％)以及PJS患者合并惡性腫瘤(19％)的年齡均較輕，平均年齡分別為17.29歲、30.4歲和37.4歲，為制定良好