滅活原生質(zhì)體融合法在蛹蟲(chóng)草優(yōu)良菌株選育中的應(yīng)用.pdf

1、蛹蟲(chóng)草（Cordyceps militaris （L.Fr）Link.）屬子囊菌門(mén)（Ascomycota）、核菌綱（Pyrenomycetes）、球殼目（Sphaeriales）、麥角菌科（Clavicipitaceae）、蟲(chóng)草屬（Cordyceps （Fr.）Link）真菌，可滋補(bǔ)強(qiáng)身、補(bǔ)肺益腎、止咳化痰，是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。 本研究從全國(guó)收集了9個(gè)蛹蟲(chóng)草菌株，編號(hào)為1-9號(hào)，通過(guò)人工培養(yǎng)觀察其農(nóng)藝性狀

2、，采用高效液相法（HPLC）測(cè)定菌絲體胞內(nèi)蟲(chóng)草素、腺苷和尿苷含量，3,5-二硝基水楊酸法（DNS）測(cè)定糖含量。研究結(jié)果顯示，4號(hào)菌株原基分化早且數(shù)量多，較適合武漢地區(qū)春季栽培，8號(hào)菌株表現(xiàn)最優(yōu)，子實(shí)體粗壯且生長(zhǎng)整齊，蟲(chóng)草素及胞內(nèi)糖含量顯著高于其它菌株。選定4號(hào)菌株和8號(hào)菌株作為滅活原生質(zhì)體融合的親本，以便篩選得到原基分化早、子實(shí)體粗壯且蟲(chóng)草素含量高的優(yōu)良子代。 原生質(zhì)體再生試驗(yàn)和最低致死時(shí)間試驗(yàn)表明，酶解5小時(shí)再生率最高，紫外滅

3、活和60℃熱處理的最低致死時(shí)間分別為8min和14min。聚乙二醇（PEG）作為融合劑，將滅活的雙親原生質(zhì)體等量混合，融合子因?yàn)闇缁钗稽c(diǎn)互補(bǔ)可以再生，未融合的親本則不能再生。 用雙層培養(yǎng)法25℃培養(yǎng)4天，隨機(jī)挑取再生菌株228個(gè)。228個(gè)再生菌株菌絲體液體培養(yǎng)20天后，酯酶同工酶電泳篩選具有雙親特異酶帶的再生菌株53個(gè)，初步判斷為融合子。HPLC法測(cè)定53個(gè)再生菌株胞內(nèi)蟲(chóng)草素等核苷物質(zhì)含量，有36株再生菌株含量與8號(hào)親本相近或高

4、于8號(hào)親本。采用ISSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，53個(gè)再生菌株中有26個(gè)菌株同時(shí)具有雙親特有帶，進(jìn)一步從分子水平表明這26個(gè)再生菌株為融合子。 對(duì)36個(gè)再生菌株人工培養(yǎng)，其中17個(gè)菌株長(zhǎng)出幼嫩子實(shí)體，但原基數(shù)量遠(yuǎn)低于雙親。綜合蟲(chóng)草素含量和人工培養(yǎng)結(jié)果，選出16株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性的測(cè)定。16個(gè)再生菌株轉(zhuǎn)管培養(yǎng)4次，測(cè)定菌絲體胞內(nèi)蟲(chóng)草素含量，比較各株每代蟲(chóng)草素含量差異，考察其遺傳穩(wěn)定性。結(jié)果表明，16株中除2株蟲(chóng)草素含量有下降趨勢(shì)外，其余