RNAi沉默G250-MN-CAIX基因?qū)δI癌Ketr-3細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響.pdf

1、研究背景 腎細(xì)胞癌簡稱腎癌，是最常見的泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一。對轉(zhuǎn)移性腎癌尚無標(biāo)準(zhǔn)治療方案，目前常采用IFN-a或(和)IL-2，或抗VEGF的多靶點激酶抑制劑二線藥物。但是上述藥物都是作用于全身，無靶點特異性。因此，需要尋找一種特異性治療方法成為抗腎癌治療的迫切需要。 G250／MN／CAIX是從多種RCC細(xì)胞系中鑒別和克隆出一種廣泛表達(dá)的腎細(xì)胞癌相關(guān)抗原。所有的腎透明細(xì)胞癌和大部分其它類型腎癌都表達(dá)G250抗原，8

2、8％的轉(zhuǎn)移灶也有該抗原表達(dá)。其在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外pH方面發(fā)揮重要的作用。可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增生和轉(zhuǎn)移，在腎癌的演變過程中起重要的作用。 目的 1.構(gòu)建針對G250的shRNA真核表達(dá)載體； 2.觀察RNAi沉默G250基因表達(dá)后，腎癌Ketr-3細(xì)胞生長速度和體外侵襲力的變化，初步了解G250在腎癌中的生物學(xué)功能，為探索腎癌的發(fā)病機(jī)理提供一定的實驗基礎(chǔ)及理論依據(jù)。 方法 1.根據(jù)Genbank中G250

3、基因的序列，合成shRNA序列，克隆至真核表達(dá)載體pSilencer 2.1-U6-neo中，構(gòu)建G250 shRNA真核表達(dá)載體，并經(jīng)PCR、限制性雙酶切和部分DNA測序鑒定； 2.經(jīng)陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至人腎癌Ketr-3細(xì)胞株中，經(jīng)G418(400μg／ml)篩選后獲得陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，命名為Ketr-3-MNRi。RT-PCR在RNA水平和Westem blot、間接免疫熒光在蛋白水平分別對干擾效率進(jìn)行檢測；

4、 3.MTT法繪制細(xì)胞生長曲線，觀察干擾后細(xì)胞生長情況的變化；Transwell侵襲小室通過過膜細(xì)胞數(shù)的差異，探討干擾因素對Ketr-3細(xì)胞的體外侵襲能力的影響。 結(jié)果 1.經(jīng)PCR、限制性雙酶切和部分DNA測序證實成功構(gòu)建了G250 shRNA的真核表達(dá)載體，經(jīng)陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Ketr-3細(xì)胞中，并經(jīng)G418篩選后獲得陽性克隆細(xì)胞株。 2.RT-PCR結(jié)果顯示Ketr-3-MNRi組對mRNA抑制下降6

5、4.4％。，Western blot結(jié)果顯示Ketr-3-MNRi的蛋白表達(dá)比Ketr-3-NC下降58.5％；間接免疫熒光顯示Ketr-3／MNRi細(xì)胞的綠色熒光比Kerr-3、Ketr-3／NC弱很多。 3.細(xì)胞生長曲線結(jié)果顯示Ketr-3-NC組細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染Ketr-3細(xì)胞兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。Ketr-3-MNRi組的腫瘤細(xì)胞生長與Ketr-3細(xì)胞，Ketr-3-NC組細(xì)胞相比較減慢(p<0.05)。

6、 4.細(xì)胞體外侵襲力結(jié)果顯示：Ketr-3-MNRi細(xì)胞其穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于陰性對照組Ketr-3-NC及Ketr-3細(xì)胞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。但Ketr-3-NC及Ketr-3細(xì)胞組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。 結(jié)論 1.成功構(gòu)建了G250 shRNA的真核表達(dá)質(zhì)粒，并經(jīng)證實對腎癌Ketr-3細(xì)胞中的G250表達(dá)具有干擾效應(yīng); 2.抑制G250表達(dá)得Ketr-3細(xì)胞生長速度及侵襲力