腎癌G250-MN-CAIX抗原基因的克隆、表達(dá)及其DNA免疫初步研究.pdf

1、研究背景：腎癌(RCC)早期診斷非常困難，治療仍以手術(shù)為主，放、化療效果不佳。近年來，在對腎癌腫瘤相關(guān)抗原的研究中，發(fā)現(xiàn)腎癌G250抗原具有良好腫瘤特異性。利用G250抗原制備的腫瘤疫苗治療晚期腎癌已取得一定進(jìn)展，G250基因修飾的樹突狀細(xì)胞(DC)疫苗研究正成為國際研究的熱點(diǎn)。制備轉(zhuǎn)導(dǎo)腎癌G250基因的DC疫苗，使其在體內(nèi)外有效激活腫瘤特異性的T細(xì)胞反應(yīng)，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)不對正常腎組織產(chǎn)生殺傷作用。目前國內(nèi)對G250抗原的研究多集

2、中在利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增其部分基因片段，以了解其在腎癌組織和腎癌患者血清中的表達(dá)情況。 Tokushige等選擇遺傳背景與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相同的腫瘤細(xì)胞作為候選靶細(xì)胞，將抗原基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，形成穩(wěn)定表達(dá)目的抗原的靶細(xì)胞，攻擊免疫動(dòng)物使其荷瘤。由于瘤細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)染的抗原，部分模擬目的抗原的攻擊作用，構(gòu)建了對相應(yīng)抗原發(fā)生免疫應(yīng)答的荷瘤小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?DNA疫苗又稱基因疫苗，其建立和發(fā)展極大程度上基于一門新興的免疫學(xué)技術(shù)——DAN

3、免疫，這種技術(shù)模擬了自然狀態(tài)下機(jī)體感染外源病原微生物表達(dá)抗原和誘導(dǎo)免疫的過程。因此，DNA免疫系統(tǒng)成為抗感染、抗腫瘤免疫等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。自1994年以來，美國FDA已批準(zhǔn)多種腫瘤相關(guān)抗原等DNA疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)。到目前為止，已發(fā)展成為以DNA免疫為特征的第三代疫苗，而關(guān)于G250的DNA疫苗相關(guān)研究尚未見類似報(bào)道。 目的克隆腎癌G250抗原基因編碼區(qū)全長序列，將其裝入真核表達(dá)載體并進(jìn)行序列測定，構(gòu)建DNA疫苗；隨后將其重組質(zhì)粒

4、轉(zhuǎn)染入小鼠sp2/0細(xì)胞中并獲得穩(wěn)定表達(dá)G250抗原的細(xì)胞模型。最后利用DNA疫苗免疫Balb/c小鼠，觀察其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，同時(shí)將sp2/0-pcDNA3.0-G250細(xì)胞接種小鼠皮下，成瘤后觀察其抑瘤效應(yīng)，為研究基于G250抗原的DC疫苗在腎癌治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。 方法：從腎癌組織中提取總RNA，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增腎癌G250抗原的基因編碼區(qū)序列，將PCR片段定向克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.0，并進(jìn)行序列測定

5、；用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將鑒定好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入sp2/0細(xì)胞中，經(jīng)G418篩選得到穩(wěn)定表達(dá)，隨后應(yīng)用RT-PCR法檢測目的基因是否克隆入小鼠sp2/0細(xì)胞mRNA中，并通過問接免疫熒光、Westernblotting等方法鑒定陽性克隆細(xì)胞是否有G250抗原表達(dá)。最后提取質(zhì)粒進(jìn)行DNA免疫，一組分離血清用間接免疫熒光法檢測血清中特異性抗體，同時(shí)取脾細(xì)胞做體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)；另一組皮下接種陽性克隆細(xì)胞后記錄腫瘤體積及荷瘤鼠存活時(shí)間。分別觀察DNA免疫

6、后誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答以及抑瘤效應(yīng)。 結(jié)果：腎癌組織RT-PCR擴(kuò)增后，均產(chǎn)生特異性條帶，位置與預(yù)定相符。克隆入載體的G250抗原基因編碼區(qū)測序序列與Genbank登錄號BC014950文獻(xiàn)報(bào)道的序列同源性為100％，目的基因與載體正確連接； 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染2周后，篩選出陽性sp2/0細(xì)胞克隆，通過RT-PCR證實(shí)有G250抗原轉(zhuǎn)錄，間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)可以見到陽性細(xì)胞，Westernblotting證實(shí)表達(dá)蛋白分子量為54kD，與預(yù)

7、定位置相符。 DNA免疫后，可見隨著免疫次數(shù)的增加，重組質(zhì)粒組免疫小鼠血清間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)陽性之抗體滴度逐漸升高，而對照組則始終為陰性；接種瘤細(xì)胞后，重組質(zhì)粒組與空質(zhì)粒組小鼠生存時(shí)間比較沒有顯著差異，Kaplan-Meier生存率曲線顯示，二組之間累計(jì)生存率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但對免疫后的接種瘤生長體積曲線進(jìn)行線性回歸，并對其斜率作t檢驗(yàn)，得t值8.34，查表得知，p＜0.01，這表明接種腫瘤細(xì)胞形成腫瘤后，兩組之間的體積差別——也

8、即是抑瘤效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)中觀察到重組質(zhì)粒免疫組小鼠脾細(xì)胞有特異性殺傷效應(yīng)，且隨免疫次數(shù)增加有上升趨勢，但是與空質(zhì)粒組之間、重組質(zhì)粒組三次免疫之間特異性殺傷率比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：1.成功克隆了腎癌G250抗原的基因編碼區(qū)全長序列，并將其克隆入真核表達(dá)載體G250-pcDNA3.0，構(gòu)建了G250DNA疫苗。 2.首次構(gòu)建并鑒定了穩(wěn)定表達(dá)G250抗原的sp2/0細(xì)胞株，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了細(xì)胞模型。