人破牙細胞的體外培養(yǎng)及MMP-12表達的研究.pdf

1、乳恒牙替換是兒童口腔中的正常生理現(xiàn)象，乳牙牙根吸收、牙槽骨改建及恒牙萌出途徑形成，是乳牙替換和恒牙正常萌出的先決條件，在這些過程中破骨細胞(osteoclast，OC)和破牙細胞(odontoclast，OD)起著重要作用。1982年Chambers和Magnus[1]首次在體外成功建立破骨細胞培養(yǎng)方法，破骨細胞在體內(nèi)數(shù)量少，且為成熟的終末細胞，不能進行細胞分裂或傳代，因此體外培養(yǎng)較困難。目前，多數(shù)研究顯示破牙細胞在形態(tài)、酶活性和代謝功

2、能等方面與破骨細胞相似，所以，破牙細胞的分離培養(yǎng)主要參考破骨細胞，多采用顱蓋骨消化法、四肢長骨機械分離法、骨髓培養(yǎng)法等間接獲得破骨細胞樣細胞(osteoclast—like cell，OLC)，作為破牙細胞的替代細胞，進行與牙體組織和骨組織吸收相關(guān)的研究[2]。本研究旨在通過酶消化法直接獲取破牙細胞，驗證成熟破牙細胞分離培養(yǎng)的可行性，得到與體內(nèi)形態(tài)、功能更為接近的體外生活破牙細胞。 破牙細胞通過分泌多種酶降解細胞外基質(zhì)參與牙體組

3、織吸收過程，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是其中最主要的酶。目前已發(fā)現(xiàn)的MMPs家族成員近30種，根據(jù)其結(jié)構(gòu)和底物特異性不同可分為7類?；|(zhì)金屬蛋白酶-12(matrix metalloproteinase-12，MMP-12)又稱為金屬彈性蛋白酶(metalloelastase)，可獨立列為一類，亦或歸類于基質(zhì)溶解素，能降解包括彈力蛋白在內(nèi)的多種細胞外基質(zhì)成分，是動脈瘤和肺氣腫等病理狀態(tài)

4、下細胞侵襲和組織破壞的關(guān)鍵酶。有研究顯示MMP-12參與動物破骨細胞性骨吸收，并能激活其他MMPs。目前對MMP-12的研究多集中于病理狀態(tài)。在生理狀態(tài)下如乳牙牙根生理性吸收過程中，MMP-12的生物學(xué)作用尚缺乏相關(guān)報道。本實驗應(yīng)用免疫細胞化學(xué)技術(shù)及免疫熒光技術(shù)檢測牙根生理性吸收過程中破牙細胞MMP-12的表達情況，為闡釋該過程的形成機制提供理論依據(jù)。 目的：采用酶消化法在體外成功地分離、培養(yǎng)、鑒定人破牙細胞，驗證成熟破牙細胞分

5、離培養(yǎng)的可行性，為后續(xù)探討其功能及調(diào)節(jié)機制奠定基礎(chǔ)；通過免疫細胞化學(xué)技術(shù)及免疫熒光技術(shù)確定乳牙牙根吸收過程中破牙細胞MMP-12的表達情況，為闡明牙根生理性吸收的機制提供理論依據(jù)。 材料與方法：①收集中山大學(xué)附屬口腔醫(yī)院兒童口腔科就診的患兒因滯留而拔除的健康乳牙，拔出后即刻浸泡于α—最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基(α—minimum essential medium，α—MEM)，低溫保存；離體健康吸收乳牙以含0.1％膠原酶(collagena

6、se)及0.2％分散酶(dispase)的α—MEM溶液37℃消化1h后，沖洗吸收根面，過濾、離心得到細胞沉淀，孵育培養(yǎng)。②人破牙細胞的組織形態(tài)學(xué)鑒定，包括倒置相差顯微鏡下觀察活細胞形態(tài)、蘇木素—伊紅染色(hematoxylin and eosin staining，HE染色)及抗酒石酸酸性磷酸酶染色(tartaric—resistant acid phosphatase staining，TRAP染色)，胞核用DAPI熒光染料進行復(fù)染

7、。③人破牙細胞的功能活性鑒定，將分離所得的細胞與人牙硬組織薄片共培養(yǎng)，掃描電鏡(scanning electron microscopy，SEM)下觀察牙薄片上形成的吸收陷窩。④利用兔抗人MMP-12的單克隆抗體，采用免疫細胞化學(xué)技術(shù)和免疫熒光技術(shù)，鑒定乳牙牙根生理性吸收過程中破牙細胞MMP-12的表達情況。 結(jié)果：①體外成功分離、培養(yǎng)人破牙細胞。倒置相差顯微鏡下觀察，離體細胞孵育2小時后，貼壁良好，偽足明顯，胞核數(shù)目不等，一個

8、至多個，清晰可見，胞漿內(nèi)可見吸收空泡。②HE染色可見大部分破牙細胞為多核巨細胞，胞核藍染；TRAP染色見破牙細胞胞漿布滿特異性的抗酒石酸酸性磷酸酶顆粒，呈特征性的酒紅色，大部分細胞具有多個胞核，熒光顯微鏡下呈藍色熒光。③通過SEM觀察，破牙細胞在人牙硬組織薄片上形成圓形、橢圓形吸收陷窩，陷窩邊界清晰，底部粗糙、膠原暴露。④免疫細胞化學(xué)技術(shù)和免疫熒光技術(shù)檢測表明，體外培養(yǎng)人破牙細胞中MMP-12在胞漿中分別呈棕色、熒光紅色著色，核周著色較