MAPK信號(hào)對(duì)高氧肺損傷Aquaporin5的調(diào)控機(jī)制.pdf

1、第一部分 MAPK通路對(duì)H<,2>O<,2>刺激狀態(tài)下MLE-12細(xì)胞AQP5表達(dá)的調(diào)控 背景:MLE-12 是小鼠來(lái)源的肺上皮細(xì)胞株，在研究肺泡上皮細(xì)胞膜蛋白表達(dá)及調(diào)節(jié)方面具有良好的特異性。已有研究證實(shí)，暴露于95％氧氣以及H<,2>O<,2>應(yīng)激可觸發(fā)轉(zhuǎn)錄因子AP-1及MAPK家族p38、JNK 成員的持續(xù)激活，從而介導(dǎo)高氧所致腫脹性細(xì)胞死亡以及細(xì)胞凋亡，且細(xì)胞的存活率在特異性抑制劑抑制MAPK活化的同時(shí)得到明顯的改善。AQ

2、P5在維持肺液體平衡以及肺水腫形成中具有關(guān)鍵性作用，已有脂多糖及腫瘤壞死因子-α對(duì)MLE-12細(xì)胞AQP5蛋白及mRNA表達(dá)影響的報(bào)道，但對(duì)于高氧誘導(dǎo)下細(xì)胞．AQP5表達(dá)的相關(guān)研究還知之甚少。本研究擬復(fù)制氧化攻擊細(xì)胞模型，研究離體氧化模型AQP5表達(dá)的變化，并通過(guò)MAPK信號(hào)途徑抑制劑阻斷其蛋白激酶的活化，觀察其對(duì)高氧應(yīng)激下MLE-12細(xì)胞AQP5表達(dá)的影響，為急性肺損傷修復(fù)探索新的方法。 目的: 1．建立氧化性細(xì)胞模型

3、。 2．觀察不同濃度、不同時(shí)間H<,2>O<,2>刺激對(duì)MLE-12細(xì)胞MAPK (ERK、 JNK、p38)的影響。 3．觀察不同濃度、不同時(shí)間H<,2>O<,2>刺激對(duì)細(xì)胞AQP5表達(dá)的影響。 4．使用MAPK信號(hào)抑制劑，研究其對(duì)MLE-12細(xì)胞AQP5表達(dá)的影響，探討MAPK途徑是否參與了MLE-12細(xì)胞AQP5的表達(dá)。 方法: 1．貼壁培養(yǎng) MLE-12，H<,2>O<,2>作為外源性RO

4、S，選用不同作用濃度(125μM、250μM、500μM、1000μM)H<,2>O<,2>刺激 1 小時(shí)及250μMH<,2>O<,2>作用不同時(shí)間，復(fù)制氧化性細(xì)胞損傷模型。 2．Western blot法檢測(cè)氧化損傷細(xì)胞磷酸化MAPK (ERK、p38、JNK)蛋白表達(dá)并采用相關(guān)抑制劑阻斷MAPK蛋白表達(dá)。 3．分別用Western blot法和FQ-PCR法檢測(cè)氧化損傷細(xì)胞AQP5蛋白及mRNA基因表達(dá)，并選用MA

5、PK信號(hào)通路抑制劑作用細(xì)胞，研究阻斷MAPK信號(hào)途徑表達(dá)后AQP5基因表達(dá)的影響。 結(jié)果: 1．MLE-12細(xì)胞磷酸化MAPK蛋白表達(dá)隨H<,2>O<,2>刺激濃度升高而逐漸增加，與對(duì)照組比較，ERK、p38及JNK三亞族在125μM H<,2>O<,2> 刺激下蛋白表達(dá)即明顯增加(P<0.05)，1000μM時(shí)最強(qiáng)，呈濃度依賴性。 2．MLE-12細(xì)胞隨H<,2>O<,2>作用時(shí)間延長(zhǎng)，磷酸化MAPK蛋白表達(dá)呈

6、上升趨勢(shì)，ERK、p38表達(dá)均在H<,2>O<,2>作用1h最強(qiáng)，但ERK在作用3h 后即降至正常，p38在H<,2>O<,2> 5h 后仍高于正常對(duì)照組；JNK 蛋白表達(dá)在H<,2>O<,2>作用 3h 最強(qiáng)，第5h與正常對(duì)照組比較無(wú)明顯差異。 3．選用ERK抑制劑PD98059 20μM、p38抑制劑SB203580 20μM、JNK抑制劑SP600125 25gM 均能抑制磷酸化ERK、p38、JNK蛋白表達(dá)。 4

7、．Western blot結(jié)果顯示：對(duì)照組AQP5蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)，在250μMH<,2>O<,2>刺激時(shí)即表達(dá)降低，后隨濃度增加呈逐漸降低趨勢(shì)；在250μMH<,2>O<,2>氧化刺激不同時(shí)間時(shí)，AQP5蛋白表達(dá)總體呈降低趨勢(shì)。不同MAPK抑制劑干預(yù)組僅見(jiàn)SB203580組AQP5蛋白表達(dá)較相應(yīng)H<,2>O<,2>刺激組增高。 5．FQ-PCR結(jié)果顯示：隨H<,2>O<,2>刺激濃度增高，AQP5 mRNA表達(dá)呈逐漸降低趨勢(shì)，以

8、500μM H<,2>O<,2>刺激時(shí)表達(dá)最低；在250μM H<,2>O<,2>作用不同時(shí)間，AQP5mRNA水平隨氧化攻擊時(shí)間的延長(zhǎng)總體呈降低趨勢(shì)。MAPK抑制劑干預(yù)組僅見(jiàn)SB203580組對(duì)AQP5mRNA表達(dá)有影響。 結(jié)論: 采用不同濃度及不同作用時(shí)間H<,2>O<,2>攻擊MLE-12作為研究高氧應(yīng)激的體外細(xì)胞模型，H<,2>O<,2>能觸發(fā)MAPK信號(hào)家族ERK、p38、JNK的激活，信號(hào)通路抑制劑可有效抑制

9、三亞族的蛋白表達(dá)；H<,2>O<,2>使MLE-12細(xì)胞AQP5 mRNA及蛋白表達(dá)呈降低趨勢(shì)，抑制MAPK信號(hào)途徑中p38 的表達(dá)可阻斷氧化應(yīng)激狀態(tài)下AQP5基因表達(dá)的降低。 第二部分 MAPK通路對(duì)高氧肺損傷動(dòng)物肺組織AOP5表達(dá)的調(diào)控 背景:急性肺損傷及急性呼吸窘迫綜合征起病急驟，發(fā)病持續(xù)，是多種高危因素引起的臨床危重疾病。近年來(lái)炎癥反應(yīng)在ALI及ARDS發(fā)病中的地位受到越來(lái)越多的關(guān)注。氧自由基是重要的炎癥介質(zhì)，多

10、形核白細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞均能產(chǎn)生氧自由基，并參與肺損傷。隨著活性氧概念的擴(kuò)展和延伸，氧氣在廣義上也屬于活性氧的范疇。吸入高濃度氧導(dǎo)致急性肺損傷在臨床中屢有發(fā)生，盡管大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示在肺損傷和肺水腫形成中AQP5發(fā)揮著重要作用，但對(duì)于高氧性肺損傷中AQP5的研究資料有限，對(duì)MAPK信號(hào)通路與高氧肺損傷二者相關(guān)性的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究少有報(bào)道。本試驗(yàn)擬建立高氧誘導(dǎo)ALI模型，探討AQP5在高氧誘導(dǎo)ALI的表達(dá)變化，并通過(guò)阻斷

11、MAPK信號(hào)通路，研究其對(duì)AQP5基因表達(dá)的影響，探明MAPK信號(hào)通路參與高氧誘導(dǎo)ALI調(diào)節(jié)AQP5的可能性，為有效控制AQP5在肺損傷的表達(dá)失衡提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 目的: 1．建立幼鼠高氧誘導(dǎo)ALI模型。 2．觀察高氧暴露對(duì)肺組織MAPK (ERK、p38、JNK)的影響并摸索在體動(dòng)物有效抑制MAPK蛋白表達(dá)的抑制劑濃度。 3．觀察高氧暴露對(duì)肺組織AQP5基因表達(dá)的影響，并應(yīng)用MAPK通路抑制劑，干預(yù)前后進(jìn)

12、行對(duì)比分析，探討AQP5的分子調(diào)控機(jī)制。 方法: 1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：幼年3周齡Wistar大鼠，隨機(jī)分為如下各組(n=6)：A組，空氣對(duì)照組；O<,3>組，高氧暴露3天組；O<,7>組，高氧暴露7天組；O<,14>組，高氧暴露14天組；O<,7>+PD組，靜脈注射ERK抑制劑PD98059后行高氧暴露7天；O<,7>+SB組，靜脈注射p38抑制劑SB203580后行高氧暴露7天；O<,7>+SP組，腹腔注射 JNK 抑制

13、劑SP600125后行高氧暴露7天；且同時(shí)設(shè)立抑制劑對(duì)照組(A+PD組、A+SB組、A+SP組)。 2．Western blot檢測(cè)肺組織磷酸化MAPK(ERK、p38、JNK)蛋白表達(dá)，并探討在體實(shí)驗(yàn)中抑制劑阻斷MAPK蛋白表達(dá)的有效濃度；免疫組化分析MAPK蛋白在肺組織的分布。 3．分別用Western blot法和IHC法檢測(cè)高氧肺損傷肺組織AQP5蛋白表達(dá)，F(xiàn)Q-PCR法分析AQP5 mRNA基因表達(dá)。并選用MA

14、PK抑制劑阻斷MAPK蛋白表達(dá)，研究其對(duì)AQP5基因表達(dá)的影響。 結(jié)果: 1．高氧誘導(dǎo) ALI 的建立：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置于高氧艙中，連續(xù)行氧濃度監(jiān)測(cè)，保證氧濃度≥95％，高氧暴露組動(dòng)物肺組織出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、水腫、出血、肺泡結(jié)構(gòu)破壞等肺損傷病理改變。 2．與空氣對(duì)照組比較，各高氧暴露組 ERK、p38、JNK 蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，phospho-ERK、phospho-JNK在O<,7>組表達(dá)升高最為明顯(P<0.05)

15、，phospho-p38在O<,14>組表達(dá)最強(qiáng)(P<0.05)；抑制劑PD98059在靜脈注射0.3mg/kg時(shí)即表現(xiàn)出對(duì)ERK蛋白表達(dá)的抑制作用，而靜脈注射 SB203580 0.2mg/kg、腹腔注射SP600125 15mg/kg可有效抑制p38、JNK的蛋白表達(dá)，且抑制效應(yīng)隨抑制劑濃度的遞增呈增強(qiáng)趨勢(shì)。 3．空氣對(duì)照組僅肺泡上皮細(xì)胞及氣道上皮細(xì)胞少量磷酸化MAPK陽(yáng)性表達(dá)，高氧肺損傷各組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多，廣泛分布在肺

16、內(nèi)不同細(xì)胞類型中，其中p38陽(yáng)性表達(dá)尤多見(jiàn)于浸潤(rùn)炎性細(xì)胞。 4．AQP5 主要表達(dá)于肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞及氣道分泌上皮頂質(zhì)膜，與空氣對(duì)照組比較，高氧損傷各組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯減少；Western blot分析見(jiàn) AQP5 蛋白表達(dá)隨高氧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)呈降低趨勢(shì)，尤以O(shè)<,7>組最為明顯；AQP5mRNA也隨高氧暴露時(shí)間增加而逐漸下調(diào)。 5．MAPK抑制劑干預(yù)后，O<,7>+SB203580、O<,7>+SP600125組肺組織

17、病理形態(tài)有明顯改善，且其AQP5蛋白及mRNA表達(dá)較高氧損傷組增加；而PD98059抑制劑組未見(jiàn)干預(yù)前后高氧肺損傷肺組織AQP5基因表達(dá)的變化。 結(jié)論: 成功復(fù)制幼年 Wistar 大鼠高氧誘導(dǎo) ALI 模型，高氧暴露可激活MAPK 信號(hào)通路ERK/p38/JNK，選用抑制劑適當(dāng)濃度即可有效阻斷MAPK 的蛋白活性；高氧肺損傷時(shí)AQP5蛋白及mRNA表達(dá)降低，三種抑制劑(PD98059/SB203580/SP600125